Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Toxoplasma gondii — це внутрішньоклітинний найпростіший паразит, який змінює мікрооточення інфікованого хазяїна і, як відомо, пов’язаний із захворюваністю на розвиток пухлини мозку.У цьому дослідженні ми припускаємо, що екзосомальна мікроРНК-21 від інфекції Toxoplasma сприяє росту пухлини мозку.Було охарактеризовано екзосоми з мікроглії BV2, інфікованої токсоплазмою, і підтверджено інтерналізацію клітин гліоми U87.Профілі експресії екзосомальних мікроРНК аналізували з використанням масивів мікроРНК і мікроРНК-21A-5p, асоційованих з Toxoplasma gondii, і сортування пухлин.Ми також досліджували рівні мРНК пухлинно-асоційованих генів у клітинах гліоми U87 шляхом зміни рівнів miR-21 в екзосомах і вплив екзосом на проліферацію клітин гліоми U87 людини.В екзосомах клітин гліоми U87, інфікованих Toxoplasma gondii, підвищена експресія мікроРНК-21 і знижена активність протипухлинних генів (FoxO1, PTEN і PDCD4).Екзосоми, отримані з BV2, інфіковані токсоплазмою, індукують проліферацію клітин гліоми U87.Екзосоми індукують ріст клітин U87 у мишачій моделі пухлини.Ми припускаємо, що підвищена екзосомальна мікроРНК-21 в інфікованій токсоплазмою мікроглії BV2 може відігравати важливу роль як стимулятор росту клітин у клітинах гліоми U87 шляхом зниження регуляції протипухлинних генів.
За оцінками, у 2018 році у світі було діагностовано понад 18,1 мільйона випадків раку на пізніх стадіях, причому щороку діагностували близько 297 000 пухлин центральної нервової системи (1,6% усіх пухлин)1.Попередні дослідження показали, що фактори ризику розвитку пухлин головного мозку людини включають різні хімічні продукти, сімейний анамнез та іонізуюче випромінювання від терапевтичного та діагностичного обладнання голови.Однак точна причина цих злоякісних новоутворень невідома.Приблизно 20% усіх випадків раку в усьому світі спричинені інфекційними агентами, включаючи віруси, бактерії та паразитів3,4.Інфекційні збудники порушують генетичні механізми клітини-господаря, такі як відновлення ДНК і клітинний цикл, і можуть призвести до хронічного запалення та пошкодження імунної системи5.
Інфекційні агенти, пов’язані з раком людини, є найпоширенішими вірусними збудниками, включаючи віруси папіломи людини та віруси гепатиту В і С.Паразити також можуть відігравати потенційну роль у розвитку раку людини.Кілька видів паразитів, а саме Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis і Hymenolepis nana, були причетні до різних типів раку людини 6,7,8.
Toxoplasma gondii є внутрішньоклітинним найпростішим, який регулює мікрооточення інфікованих клітин господаря.За оцінками, цим паразитом інфіковано приблизно 30% населення світу, піддаючи ризику все населення9,10.Toxoplasma gondii може вражати життєво важливі органи, включаючи центральну нервову систему (ЦНС), і викликати такі серйозні захворювання, як смертельний менінгіт і енцефаліт, особливо у пацієнтів з ослабленим імунітетом9.Однак Toxoplasma gondii також може змінювати середовище інфікованого хазяїна шляхом модуляції росту клітин та імунної відповіді в імунокомпетентних осіб, що призводить до підтримки безсимптомної хронічної інфекції9,11.Цікаво, що враховуючи кореляцію між поширеністю T. gondii та захворюваністю на пухлину головного мозку, деякі звіти припускають, що in vivo зміни навколишнього середовища господаря внаслідок хронічної інфекції T. gondii нагадують мікрооточення пухлини.
Екзосоми відомі як міжклітинні комунікатори, які доставляють біологічний вміст, включаючи білки та нуклеїнові кислоти, із сусідніх клітин16,17.Екзосоми можуть впливати на пов’язані з пухлиною біологічні процеси, такі як антиапоптоз, ангіогенез і метастазування в мікрооточенні пухлини.Зокрема, мікроРНК (міРНК), малі некодуючі РНК довжиною близько 22 нуклеотидів, є важливими посттранскрипційними генними регуляторами, які контролюють понад 30% мРНК людини через індукований мікроРНК комплекс мовчання (miRISC).Toxoplasma gondii може порушувати біологічні процеси, контролюючи експресію мікроРНК в інфікованих господарях.МіРНК господаря містять важливі сигнали для регулювання біологічних процесів господаря для досягнення стратегії виживання паразита.Таким чином, вивчення змін у профілі мікроРНК господаря після зараження T. gondii може допомогти нам чіткіше зрозуміти взаємодію між господарем і T. gondii.Дійсно, Thirugnanam та ін.15 припустили, що T. gondii сприяє канцерогенезу мозку, змінюючи його експресію на специфічних мікроРНК хазяїна, пов’язаних із ростом пухлини, і виявили, що T. gondii може викликати гліоми в експериментальних тварин.
Це дослідження зосереджено на зміні екзосомальної мікроРНК-21 у мікроглії господаря, інфікованої Toxoplasma BV2.Ми спостерігали можливу роль зміненої екзосомальної мікроРНК-21 у зростанні клітин гліоми U87 через утримання в ядрі FoxO1/p27, який є мішенню для надмірно експресованої мікроРНК-21.
Екзосоми, отримані з BV2, були отримані за допомогою диференціального центрифугування та перевірені різними методами для запобігання забрудненню клітинними компонентами або іншими везикулами.Електрофорез у SDS-поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) показав чіткі закономірності між білками, екстрагованими з клітин BV2 та екзосом (рис. 1A), і зразки були оцінені на наявність Alix, який був проаналізований вестерн-блоттингом маркерів екзосомальних білків у .Мічення Alix було виявлено в білках екзосом, але не в білках лізату клітин BV2 (рис. 1B).Крім того, очищену РНК з екзосом, отриманих з BV2, аналізували за допомогою біоаналізатора.Рибосомальні субодиниці 18S і 28S рідко спостерігалися в паттерні міграції екзосомальної РНК, що вказує на надійну чистоту (рис. 1C).Нарешті, трансмісійна електронна мікроскопія показала, що спостережувані екзосоми мали розмір приблизно 60–150 нм і мали чашеподібну структуру, типову для морфології екзосом (рис. 1D).
Характеристика екзосом, отриманих з клітин BV2.(A) Сторінка паспорта безпеки.Білки були виділені з клітин BV2 або екзосом, отриманих з BV2.Білкові структури відрізняються між клітинами та екзосомами.(B) Вестерн-блот аналіз екзосомального маркера (Alix).(C) Оцінка очищеної РНК з клітин BV2 та похідних екзосом BV2 за допомогою біоаналізатора.Таким чином, рибосомальні субодиниці 18S і 28S у клітинах BV2 рідко виявлялися в екзосомній РНК.(D) Трансмісійна електронна мікроскопія показала, що екзосоми, виділені з клітин BV2, були негативно забарвлені 2% уранілацетатом.Екзосоми мають розмір приблизно 60-150 нм і форму чаші (Сонг і Юнг, неопубліковані дані).
Клітинну інтерналізацію екзосом, отриманих з BV2, у клітини гліоми людини U87 спостерігали за допомогою конфокальної мікроскопії.Екзосоми, мічені PKH26, локалізовані в цитоплазмі клітин U87.Ядра фарбували DAPI (рис. 2A), що вказує на те, що екзосоми, отримані з BV2, можуть бути інтерналізовані клітинами-господарями та впливати на середовище клітин-реципієнтів.
Інтерналізація екзосом, похідних від BV2, у клітини гліоми U87 та екзосом, похідних від BV2, інфікованих Toxoplasma RH, викликала проліферацію клітин гліоми U87.(A) Екзосоми, охоплені клітинами U87, виміряні конфокальною мікроскопією.Клітини гліоми U87 інкубували з екзосомами, міченими PKH26 (червоний) або без контролю протягом 24 годин.Ядра фарбували DAPI (синім) і потім спостерігали під конфокальним мікроскопом (масштабна шкала: 10 мкм, x 3000).(B) Проліферацію клітин гліоми U87 визначали за допомогою аналізу проліферації клітин.Клітини гліоми U87 обробляли екзосомами протягом зазначеного часу. *P <0,05 отримано за t-критерієм Стьюдента. *P <0,05 отримано за t-критерієм Стьюдента. *P < 0,05 отримано за t-критерієм Стюдента. *P <0,05 за t-критерієм Стьюдента. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P < 0,05, отриманий за допомогою t-критерію Стюдента. * P < 0,05 отримано за допомогою t-критерію Стьюдента.
Після підтвердження інтерналізації екзосом, отриманих від BV2, у клітини гліоми U87, ми провели аналізи проліферації клітин, щоб дослідити роль екзосом, отриманих від BV2, отриманих від токсоплазми, у розвитку клітин гліоми людини.Обробка клітин U87 екзосомами з T. gondii-інфікованих клітин BV2 показала, що T. gondii-інфіковані екзосоми, похідні від BV2, викликали значно вищу проліферацію клітин U87 порівняно з контролем (рис. 2B).
Крім того, ріст клітин U118 мав такі ж результати, як і U87, оскільки екзосоми, стимульовані Toxoplasma, викликали найвищий рівень проліферації (дані не показані).На основі цих даних ми можемо вказати, що інфіковані токсоплазмою екзосоми, отримані з BV2, відіграють важливу роль у проліферації клітин гліоми.
Щоб дослідити вплив екзосом, отриманих від токсоплазми BV2, на розвиток пухлини, ми ввели клітини гліоми U87 голим мишам для моделі ксенотрансплантата та ввели екзосоми, отримані від BV2, або інфіковані RH екзосоми, отримані від BV2.Після того, як пухлини стали очевидними через 1 тиждень, кожну експериментальну групу з 5 мишей розділили відповідно до розміру пухлини, щоб визначити ту саму вихідну точку, і розмір пухлини вимірювали протягом 22 днів.
У мишей з моделлю ксенотрансплантата U87 спостерігали значно більший розмір і вагу пухлини в групі екзосом, інфікованих RH, що походять від BV2, на 22-й день (рис. 3A, B).З іншого боку, не було істотної різниці в розмірі пухлини між групою екзосом, отриманих з BV2, і контрольною групою після лікування екзосомами.Крім того, миші, яким вводили клітини гліоми та екзосоми, візуально демонстрували найбільший об’єм пухлини в групі інфікованих RH екзосом, похідних від BV2 (рис. 3C).Ці результати демонструють, що BV2-похідні інфіковані токсоплазмою екзосоми індукують ріст гліоми в мишачій моделі пухлини.
Онкогенез (AC) екзосом, отриманих з BV2, у мишачій моделі ксенотрансплантата U87.Розмір пухлини (A) і вага (B) були значно збільшені у голих мишей BALB/c, які отримували RH-інфіковані екзосоми, отримані з BV2.Голим мишам BALB/c (C) підшкірно вводили 1 × 107 клітин U87, суспендованих у суміші Matrigel.Через шість днів після ін'єкції мишам вводили 100 мкг екзосом, отриманих з BV2.Розмір і вагу пухлини вимірювали у вказані дні та після умертвіння відповідно. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Дані показали, що 37 мікроРНК (16 із гіперекспресією та 21 із зниженою експресією), пов’язаних з імунітетом або розвитком пухлини, були значно змінені в мікроглії після зараження штамом Toxoplasma RH (рис. 4A).Відносні рівні експресії мікроРНК-21 серед змінених мікроРНК були підтверджені RT-PCR в реальному часі в екзосомах, отриманих з BV2, екзосомах, оброблених клітинами BV2 та U87.Експресія miR-21 показала значне збільшення екзосом з клітин BV2, інфікованих Toxoplasma gondii (штам RH) (рис. 4B).Відносні рівні експресії miR-21 у клітинах BV2 та U87 зросли після поглинання змінених екзосом (рис. 4B).Відносні рівні експресії miR-21 у тканинах мозку пацієнтів із пухлиною та мишей, інфікованих Toxoplasma gondii (штам ME49), були вищими, ніж у контрольній групі відповідно (рис. 4C).Ці результати корелюють з відмінностями між рівнями експресії прогнозованих і підтверджених мікроРНК in vitro та in vivo.
Зміни в експресії екзосомального miP-21a-5p в мікроглії, інфікованій Toxoplasma gondii (RH).(A) Демонструє значні зміни в siRNA, пов’язані з імунітетом або розвитком пухлини після інфекції T. gondii RH.(B) Відносні рівні експресії miR-21 були виявлені за допомогою RT-PCR в реальному часі в екзосомах, отриманих з BV2, екзосомах, оброблених BV2, і клітинах U87.(C) Відносні рівні експресії miR-21 були виявлені в тканинах мозку пацієнтів з пухлиною (N=3) і мишей, інфікованих Toxoplasma gondii (штам ME49) (N=3). *P <0,05 отримано за t-критерієм Стьюдента. *P <0,05 отримано за t-критерієм Стьюдента. *P < 0,05 отримано за допомогою t-критерію Стюдента. *P <0,05 було отримано за допомогою t-критерію Стьюдента. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, отриманий за допомогою t-критерію Стюдента. * P < 0,05 отримано за допомогою t-критерію Стьюдента.
Екзосоми з RH-інфікованих клітин BV2 призвели до росту гліом in vivo та in vitro (рис. 2, 3).Щоб виявити відповідні мРНК, ми перевірили рівні мРНК протипухлинних генів-мішеней, вилочної коробки O1 (FoxO1), PTEN і програмованої клітинної смерті 4 (PDCD4) у клітинах U87, інфікованих екзосомами, отриманими з BV2 або RH BV2.Біоінформаційний аналіз показав, що кілька генів, асоційованих з пухлиною, включаючи гени FoxO1, PTEN і PDCD4, мають сайти зв’язування miR-2121,22.Рівні мРНК протипухлинних цільових генів були знижені в RH-інфікованих екзосомах, отриманих від BV2, порівняно з екзосомами, отриманими від BV2 (рис. 5A).FoxO1 продемонстрував знижені рівні білка в екзосомах, похідних від BV2, інфікованих RH, порівняно з екзосомами, похідними від BV2 (рис. 5B).На основі цих результатів ми могли підтвердити, що екзосоми, отримані з RH-інфікованого BV2, знижують регуляцію антионкогенних генів, зберігаючи свою роль у зростанні пухлини.
Інфіковані Toxoplasma RH екзосоми, похідні від BV2, індукують пригнічення протипухлинних генів у клітинах гліоми U87 екзосомами, похідними від Toxoplasma RH.(A) ПЛР у режимі реального часу експресії FoxO1, PTEN і PDCD4 в екзосомах, отриманих від T. gondii RH-інфікованого BV2, порівняно з екзосомами PBS.Як контроль використовували мРНК β-актину.(B) Експресію FoxO1 визначали вестерн-блоттингом, а дані денситометрії статистично оцінювали за допомогою програми ImageJ. *P <0,05 отримано за t-критерієм Стьюдента. *P <0,05 отримано за t-критерієм Стьюдента. *P < 0,05 отримано за допомогою t-критерію Стюдента. *P <0,05 було отримано за допомогою t-критерію Стьюдента. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, отриманий за допомогою t-критерію Стюдента. * P < 0,05 отримано за допомогою t-критерію Стьюдента.
Щоб зрозуміти вплив miP-21 в екзосомах на регуляцію асоційованого з пухлиною гена, клітини U87 трансфікували інгібітором miP-21 за допомогою Lipofectamine 2000, і клітини збирали через 24 години після трансфекції.Рівні експресії FoxO1 і p27 у клітинах, трансфікованих інгібіторами miR-21, порівнювали з клітинами, обробленими екзосомами, отриманими з BV2, за допомогою qRT-PCR (рис. 6A, B).Трансфекція інгібітора miR-21 у клітини U87 значно знижувала регуляцію експресії FoxO1 і p27 (Фіг. 6).
Інфікований RH екзосомальний miP-21, отриманий з BV2, змінював експресію FoxO1/p27 у клітинах гліоми U87.Клітини U87 трансфікували інгібітором miP-21 з використанням Lipofectamine 2000 і клітини збирали через 24 години після трансфекції.Рівні експресії FoxO1 і p27 у клітинах, трансфікованих інгібіторами miR-21, порівнювали з рівнями в клітинах, оброблених екзосомами, отриманими з BV2, за допомогою qRT-PCR (A, B).
Щоб уникнути імунної відповіді хазяїна, паразит Toxoplasma трансформується в тканинну цисту.Вони паразитують у різних тканинах, включаючи мозок, серце та скелетні м’язи, протягом усього життя господаря та модулюють імунну відповідь господаря.Крім того, вони можуть регулювати клітинний цикл і апоптоз клітин-господарів, сприяючи їх проліферації14,24.Toxoplasma gondii переважно інфікує дендритні клітини хазяїна, нейтрофіли та лінію моноцитів/макрофагів, включаючи мікроглію мозку.Toxoplasma gondii індукує диференціацію макрофагів фенотипу М2, впливає на загоєння ран після інфікування патогеном, а також асоціюється з гіперваскуляризацією та гранулематозним фіброзом.Цей поведінковий патогенез інфекції Toxoplasma може бути пов’язаний з маркерами, пов’язаними з розвитком пухлини.Вороже середовище, яке регулюється токсоплазмою, може нагадувати відповідний передрак.Тому можна припустити, що токсоплазмова інфекція повинна сприяти розвитку пухлин головного мозку.Насправді повідомлялося про високі показники інфікування токсоплазмою в сироватці крові пацієнтів з різними пухлинами мозку.Крім того, Toxoplasma gondii може бути ще одним канцерогенним ефектором і діяти синергічно, допомагаючи іншим інфекційним канцерогенам розвивати пухлини мозку.У зв’язку з цим варто зазначити, що P. falciparum і вірус Епштейна-Барр синергетично сприяють утворенню лімфоми Беркітта.
Роль екзосом як регуляторів у галузі дослідження раку була широко досліджена.Однак роль екзосом між паразитами та інфікованими господарями залишається недостатньо вивченою.Досі різні регулятори, включаючи секретовані білки, пояснили біологічні процеси, за допомогою яких найпростіші паразити протистоять нападу господаря та увічнюють інфекцію.Останнім часом поширюється концепція про те, що асоційовані з найпростішими мікровезикули та їх мікроРНК взаємодіють з клітинами-господарями, щоб створити сприятливе середовище для їх виживання.Тому необхідні подальші дослідження, щоб виявити зв'язок між зміненими екзосомальними мікроРНК і проліферацією клітин гліоми.Зміна мікроРНК (кластерні гени miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 і miR-17-92) зв'язується з промотором STAT3 в інфікованих токсоплазмою макрофагах людини, регулюється та індукує анти- -апоптоз у відповідь на інфекцію Toxoplasma gondii 29 .Інфекція токсоплазмою збільшує експресію miR-17-5p і miR-106b-5p, які пов’язані з кількома гіперпроліферативними захворюваннями 30 .Ці дані свідчать про те, що мікроРНК господаря, які регулюються токсоплазмовою інфекцією, є важливими молекулами для виживання паразитів і патогенезу біологічної поведінки господаря.
Змінені мікроРНК можуть впливати на різні типи поведінки під час ініціації та прогресування злоякісних клітин, включаючи гліоми: самодостатність сигналів росту, нечутливість до сигналів, що пригнічують ріст, ухилення від апоптозу, необмежений реплікативний потенціал, ангіогенез, інвазія та метастазування, а також запалення.У гліомі змінені мікроРНК були ідентифіковані в кількох дослідженнях профілю експресії.
У цьому дослідженні ми підтвердили високі рівні експресії мікроРНК-21 в клітинах господаря, інфікованих токсоплазмою.МіР-21 була визначена як одна з мікроРНК, яка найчастіше надекспресується в солідних пухлинах, включаючи гліоми, 33 і її експресія корелює зі ступенем гліоми.Накопичені дані свідчать про те, що miR-21 є новим онкогеном, який діє як антиапоптотичний фактор у зростанні гліоми та має високу надмірну експресію в тканинах і плазмі злоякісних пухлин мозку людини.Цікаво, що інактивація miR-21 у клітинах і тканинах гліоми викликає інгібування проліферації клітин через каспазозалежний апоптоз.Біоінформаційний аналіз прогнозованих мішеней miR-21 виявив кілька генів-супресорів пухлин, пов’язаних із шляхами апоптозу, включаючи запрограмовану клітинну смерть 4 (PDCD4), тропоміозин (TPM1), PTEN і вилочну коробку O1 (FoxO1), із сайтом зв’язування miR-2121..22.38.
FoxO1, як один із факторів транскрипції (FoxO), бере участь у розвитку різних типів раку людини і може регулювати експресію генів-супресорів пухлин, таких як p21, p27, Bim і FasL40.FoxO1 може зв'язувати та активувати інгібітори клітинного циклу, такі як p27, для придушення росту клітин.Крім того, FoxO1 є ключовим ефектором сигналізації PI3K/Akt і регулює багато біологічних процесів, таких як прогресування клітинного циклу та диференціація клітин через активацію транскрипції p2742.
На закінчення ми вважаємо, що екзосомальна мікроРНК-21, отримана з інфікованої токсоплазмою мікроглії, може відігравати важливу роль як регулятор росту клітин гліоми (рис. 7).Проте необхідні подальші дослідження, щоб знайти прямий зв’язок між екзосомальною мікроРНК-21, зміненою інфекцією токсоплазми та ростом гліоми.Очікується, що ці результати стануть відправною точкою для вивчення зв’язку між інфекцією токсоплазмою та частотою гліоми.
У цьому дослідженні пропонується схематична схема механізму канцерогенезу гліоми (мозку).Автор малює в PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Усі експериментальні протоколи в цьому дослідженні, включно з використанням тварин, відповідали Стандартним етичним рекомендаціям Сеульського національного університету з догляду за тваринами та комітету користувачів і були схвалені Інституційною ревізійною радою Медичної школи Сеульського національного університету (номер IRB SNU- 150715).-2).Усі експериментальні процедури були проведені відповідно до рекомендацій ARRIVE.
Клітини мікроглії BV2 миші та клітини гліоми людини U87 культивували в середовищі Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) та середовищі Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), відповідно, кожна з яких містила 10% фетальної бичачої сироватки, 4 мМ l- глутамін, 0,2 мМ пеніцилін і 0,05 мМ стрептоміцин.Клітини культивували в інкубаторі з 5% CO2 при 37°C.Іншу лінію клітин гліоми, U118, використовували для порівняння з клітинами U87.
Для виділення екзосом із штамів RH і ME49, інфікованих T. gondii, тахізоїти T. gondii (штам RH) збирали з черевної порожнини 6-тижневих мишей BALB/c, яким вводили за 3-4 дні до цього.Тахізоїти тричі промивали PBS і очищали центрифугуванням у 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Для отримання тахізоітів штаму ME49 мишам BALB/c внутрішньочеревно вводили 20 тканинних цист і збирали трансформацію тахізоітів у цистах шляхом промивання черевної порожнини на 6-8-й день після інфікування (ПІ).Миші, інфіковані PBS.Тахізоїти ME49 вирощували в клітинах, доповнених 100 мкг/мл пеніциліну (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), 100 мкг/мл стрептоміцину (Gibco/BRL) і 5% фетальної бичачої сироватки (Lonza, Walkersville, MD) .., США) при 37 °C і 5% вуглекислого газу.Після культивування в клітинах Vero тахізоїти ME49 двічі пропускали через голку 25 калібру, а потім через фільтр 5 мкм для видалення сміття та клітин.Після промивання тахізоїти ресуспендували в PBS44.Тканинні цисти штаму ME49 Toxoplasma gondii підтримували шляхом внутрішньочеревної ін’єкції цист, виділених із мозку інфікованих мишей C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Мозок мишей, інфікованих ME49, збирали після 3 місяців PI і подрібнювали під мікроскопом для виділення цист.Інфікованих мишей утримували в спеціальних умовах, вільних від патогенів (SPF) у Школі медицини Сеульського національного університету.
Загальну РНК екстрагували з екзосом, отриманих з BV2, клітин і тканин BV2, використовуючи міні-набір miRNeasy (Qiagen, Hilden, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника, включаючи час інкубації для етапу елюції.Концентрацію РНК визначали на спектрофотометрі NanoDrop 2000.Якість мікрочіпів РНК оцінювали за допомогою біоаналізатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Нідерланди).
DMEM з 10% бідної екзосомами FBS готували ультрацентрифугуванням при 100 000g протягом 16 годин при 4°C і фільтрували через фільтр 0,22 мкм (Nalgene, Рочестер, Нью-Йорк, США).Клітини BV2, 5 × 105, культивували в DMEM, що містить 10% виснаженого екзосомами FBS і 1% антибіотиків при 37°C і 5% CO2.Після 24 годин інкубації до клітин додавали тахізоїти штаму RH або ME49 (MOI = 10), а паразитів, які не вторглися, видаляли протягом години та знову заповнювали DMEM.Екзосоми з клітин BV2 виділяли модифікованим диференціальним центрифугуванням, найбільш широко використовуваним методом.Ресуспендуйте осад екзосоми в 300 мкл PBS для аналізу РНК або білка.Концентрацію ізольованих екзосом визначали за допомогою набору для аналізу білків BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) і спектрофотометра NanoDrop 2000.
Преципітати з клітин BV2 або екзосом, отриманих з BV2, лізували в розчині для екстракції білка PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Корея), а білки завантажували на 10% SDS поліакриламідні гелі, забарвлені кумасі блискучим синім.Крім того, білки переносили на мембрани PVDF протягом 2 годин.Вестерн-блоти перевіряли з використанням антитіла Alix (Cell Signaling Technology, Беверлі, Массачусетс, США) як екзосомального маркера.HRP-кон’югований козячий антимишачий IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Монтгомері, Техас, США) і аналізатор люмінесцентного зображення LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Токіо, Японія) використовували як вторинне антитіло..Просвічуюча електронна мікроскопія була проведена для вивчення розміру та морфології екзосом.Екзосоми, виділені з клітин BV2 (6,40 мкг/мкл), готували на вуглецевих сітках і негативно фарбували 2% уранілацетатом протягом 1 хв.Підготовлені зразки спостерігали при прискорювальній напрузі 80 кВ за допомогою JEOL 1200-EX II (Токіо, Японія), оснащеного камерою ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, США).
Екзосоми, отримані з BV2, фарбували за допомогою набору PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) протягом 15 хвилин при кімнатній температурі.Клітини U87, 2×105, з міченими PKH26 екзосомами (червоним) або без екзосом як негативного контролю, інкубували при 37°C протягом 24 годин в інкубаторі з 5% CO2.Ядра клітин U87 фарбували DAPI (синім), клітини U87 фіксували в 4% параформальдегіді протягом 15 хвилин при 4°C, а потім аналізували в системі конфокального мікроскопа Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Мангейм, Німеччина).спостережуваний.
кДНК синтезували з siRNA за допомогою синтезу першого ланцюга siRNA Mir-X і набору SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Кількісну ПЛР у реальному часі проводили за допомогою системи виявлення ПЛР у реальному часі iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, США) з використанням праймерів і матриць, змішаних із преміксом SYBR.ДНК ампліфікували протягом 40 циклів денатурації при 95°С протягом 15 с і відпалу при 60°С протягом 60 с.Дані кожної реакції ПЛР аналізували за допомогою модуля аналізу даних програмного забезпечення оптичної системи iQ™5 (Bio-Rad).Відносні зміни в експресії генів між обраними цільовими генами та β-актином/міРНК (і U6) розраховували за допомогою методу стандартної кривої.Використані послідовності праймерів наведено в таблиці 1.
3 x 104 клітин гліоми U87 висівали в 96-лункові планшети та змішували з інфікованими токсоплазмою екзосомами, отриманими з BV2 (50 мкг/мл), або непульсовими екзосомами, отриманими з BV2 (50 мкг/мл), як контролі через 12, 18 і 36 годин. .Швидкість проліферації клітин визначали за допомогою набору Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (додаткові малюнки S1-S3) 46 .
5-тижневих самок голих мишей BALB/c купували в Orient Bio (Соннам-сі, Південна Корея) і тримали окремо в стерильних клітках при кімнатній температурі (22±2°C) і вологості (45±15°C).%) при кімнатній температурі (22±2°C) і вологості (45±15%).12-годинний цикл світла та 12-годинний цикл темряви проводили під SPF (Центр тварин Медичної школи Сеульського національного університету).Мишей випадковим чином розділили на три групи по 5 мишей у кожній, і всім групам підшкірно ввели 400 мл PBS, що містив 1 × 107 клітин гліоми U87 і BD Matrigel™ зі зниженим вмістом фактора росту (BD Science, Маямі, Флорида, США).Через шість днів після ін’єкції пухлини 200 мг екзосом, отриманих з клітин BV2 (з/без інфекції Toxoplasma), вводили в місце пухлини.Через двадцять два дні після зараження пухлиною розмір пухлини мишей у кожній групі вимірювали штангенциркулем тричі на тиждень і обчислювали об’єм пухлини за формулою: 0,5×(ширина)×2×довжина.
Аналіз експресії мікроРНК з використанням масиву мікроРНК miRCURYTM LNA, масиви mmu та rno 7-го покоління (EXIQON, Vedbaek, Данія), що охоплює 1119 добре охарактеризованих мишей серед 3100 зондів захоплення мікроРНК людини, миші та щура.Під час цієї процедури від 250 до 1000 нг загальної РНК було видалено з 5'-фосфату обробкою кишковою лужною фосфатазою теляти з наступним міченням зеленим флуоресцентним барвником Hy3.Потім мічені зразки гібридизували шляхом завантаження мікроматричних предметних стекол з використанням набору для гібридизаційної камери (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США) і набору для гібридизаційних слайдів (Agilent Technologies).Гібридизацію проводили протягом 16 годин при 56°С, потім мікрочипи промивали згідно з рекомендаціями виробника.Потім оброблені слайди мікроматриць сканували за допомогою системи сканування мікроматриць Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Відскановані зображення імпортували за допомогою програмного забезпечення Agilent Feature Extraction версії 10.7.3.1 (Agilent Technologies), а інтенсивність флуоресценції кожного зображення кількісно визначали за допомогою відповідного файлу GAL модифікованого протоколу Exiqon.Дані мікрочіпів для поточного дослідження зберігаються в базі даних GEO під номером доступу GPL32397.
Профілі експресії зрілих екзосомальних мікроРНК у мікроглії штамів RH або ME49, інфікованих токсоплазмою, аналізували за допомогою різних мережевих інструментів.мікроРНК, пов'язані з розвитком пухлини, ідентифікували за допомогою miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) і відфільтрували з нормалізованою інтенсивністю сигналу (log2) більше 8,0.Серед мікроРНК було виявлено, що диференційовано експресовані мікроРНК були змінені більш ніж у 1,5 рази за допомогою фільтраційного аналізу мікроРНК, змінених штамами RH або ME49, інфікованими T. gondii.
Клітини висівали в шестилункові планшети (3 х 105 клітин на лунку) в opti-MEM (Gibco, Карлсбад, Каліфорнія, США) з використанням Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США).Трансфіковані клітини культивували протягом 6 годин, а потім середовище замінювали на свіже повне середовище.Клітини збирали через 24 години після трансфекції.
Статистичний аналіз в основному проводили за допомогою t-критерію Стьюдента з програмним забезпеченням Excel (Microsoft, Вашингтон, округ Колумбія, США).Для експериментального аналізу на тваринах проводили двосторонній дисперсійний аналіз за допомогою програмного забезпечення Prism 3.0 (програмне забезпечення GraphPad, La Jolla, CA, США). P-значення < 0,05 вважалися статистично значущими. Р-значення < 0,05 вважалися статистично значущими. Значення P <0,05 вважалися статистично значущими. Значення P <0,05 вважалися статистично значущими. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значення P <0,05 вважалися статистично значущими. Значення P <0,05 вважалися статистично значущими.
Усі експериментальні протоколи, використані в цьому дослідженні, були схвалені Інституційною ревізійною радою Школи медицини Сеульського національного університету (номер IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. та ін.Оцінка глобальної захворюваності та смертності від раку в 2018 році: джерела та методи GLOBOCAN.Інтерпретація.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Погляд на фактори ризику пухлин головного мозку та їх терапевтичне втручання. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Погляд на фактори ризику пухлин головного мозку та їх терапевтичне втручання.Рашид С., Реман К. та Акаш М. С. Огляд факторів ризику пухлин головного мозку та основних терапевтичних втручань. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Глибоке розуміння факторів ризику пухлин головного мозку та терапевтичних втручань.Рашид С., Реман К. та Акаш М. С. Огляд факторів ризику пухлин головного мозку та основних терапевтичних втручань.Біомедична наука.Фармацевт.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактеріально-вірусні взаємодії при раку ротової порожнини та раку жіночих статевих шляхів людини: короткий виклад епідеміологічних та лабораторних даних. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактеріально-вірусні взаємодії при раку ротової порожнини та раку жіночих статевих шляхів людини: короткий виклад епідеміологічних та лабораторних даних.Kato I., Zhang J. та Sun J. Бактеріально-вірусні взаємодії при раку шлунково-кишкового тракту людини та жіночих статевих шляхів: підсумок епідеміологічних та лабораторних даних. Като, І., Чжан, Дж. та Сан, Дж.据总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактеріально-вірусна взаємодія в травленні ротової порожнини людини та жіночих репродуктивних шляхах: підсумок науково-популярних захворювань і лабораторні дані.Kato I., Zhang J. та Sun J. Бактеріально-вірусні взаємодії при раку шлунково-кишкового тракту людини та раку жіночих статевих органів: підсумок епідеміологічних та лабораторних даних.Рак 14, 425 (2022).
Магон, К. Л. та Періш, Дж. Л. Від інфекції до раку: як пухлинні віруси ДНК змінюють центральний вуглецевий і ліпідний метаболізм клітини-господаря. Магон, К. Л. та Періш, Дж. Л. Від інфекції до раку: як пухлинні віруси ДНК змінюють центральний вуглецевий і ліпідний метаболізм клітини-господаря.Mahon, KL і Parish, JL Від інфекції до раку: як пухлинні віруси на основі ДНК змінюють центральний метаболізм вуглецю та ліпідів у клітинах господаря. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：ДНК 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Від інфекції до раку: як пухлинні віруси ДНК змінюють центральний метаболізм вуглецю та ліпідів у клітині господаря.Махон, К. Л. і Періш, Дж. Л. Переносять інфекцію до раку: як пухлинні віруси ДНК змінюють центральний метаболізм вуглецю та ліпідів у клітинах господаря.Відкрита біологія.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM та ін.Катехолові естрогени шистосом і печінкових сосальщиків і асоційованого з гельмінтами раку.спереду.гаряче всередині.5, 444 (2014).