Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Генні вектори для лікування легеневого муковісцидозу повинні бути націлені на провідні дихальні шляхи, оскільки периферична легенева трансдукція не має терапевтичного ефекту.Ефективність вірусної трансдукції безпосередньо залежить від часу перебування носія.Однак рідини для доставки, такі як носії генів, природним чином дифундують в альвеоли під час інгаляції, і терапевтичні частинки будь-якої форми швидко видаляються мукоциліарним транспортом.Подовження часу перебування носіїв генів у дихальних шляхах важливо, але важко досягти.Магнітні частинки, спряжені з носієм, які можуть бути спрямовані на поверхню дихальних шляхів, можуть покращити регіональне націлювання.Через проблеми із зображенням in vivo поведінка таких малих магнітних частинок на поверхні дихальних шляхів у присутності прикладеного магнітного поля погано вивчена.Метою цього дослідження було використання синхротронної візуалізації для візуалізації in vivo руху серії магнітних частинок у трахеї щурів під наркозом, щоб вивчити динаміку та закономірності поведінки окремих і масових частинок in vivo.Потім ми також оцінили, чи збільшить доставку лентивірусних магнітних частинок у присутності магнітного поля ефективність трансдукції в трахеї щура.Синхротронне рентгенівське зображення показує поведінку магнітних частинок у стаціонарних і рухомих магнітних полях in vitro та in vivo.Частинки неможливо легко перетягнути по поверхні живих дихальних шляхів за допомогою магнітів, але під час транспортування відкладення концентруються в полі зору, де магнітне поле найсильніше.Ефективність трансдукції також була збільшена в шість разів, коли лентивірусні магнітні частинки доставлялися в присутності магнітного поля.У сукупності ці результати свідчать про те, що лентивірусні магнітні частинки та магнітні поля можуть бути цінними підходами для покращення націлювання генного вектора та рівнів трансдукції в провідних дихальних шляхах in vivo.
Муковісцидоз (МВ) спричинений варіаціями в одному гені, що називається регулятором трансмембранної провідності (CFTR).Білок CFTR є іонним каналом, який присутній у багатьох епітеліальних клітинах по всьому тілу, включаючи дихальні шляхи, головне місце в патогенезі муковісцидозу.Дефекти CFTR призводять до ненормального транспорту води, дегідратації поверхні дихальних шляхів і зменшення глибини шару рідини на поверхні дихальних шляхів (ASL).Це також погіршує здатність системи мукоциліарного транспорту (MCT) очищати дихальні шляхи від вдихуваних часток і патогенів.Наша мета — розробити лентивірусну (LV) генну терапію для доставки правильної копії гена CFTR і покращити ASL, MCT і здоров’я легенів, а також продовжити розробку нових технологій, які можуть вимірювати ці параметри in vivo1.
Вектори LV є одними з провідних кандидатів для генної терапії муковісцидозу, головним чином тому, що вони можуть постійно інтегрувати терапевтичний ген у базальні клітини дихальних шляхів (стволові клітини дихальних шляхів).Це важливо, оскільки вони можуть відновити нормальну гідратацію та очищення слизу шляхом диференціації у функціональні генно-кориговані клітини поверхні дихальних шляхів, пов’язані з кістозним фіброзом, що призводить до довічних переваг.Вектори ЛШ повинні бути спрямовані проти провідних дихальних шляхів, оскільки саме тут починається ураження легенів при МВ.Доставка вектора глибше в легені може призвести до альвеолярної трансдукції, але це не має терапевтичного ефекту при муковісцидозі.Однак рідини, такі як носії генів, природним чином мігрують в альвеоли при вдиханні після пологів3,4, і терапевтичні частинки швидко викидаються в ротову порожнину MCT.Ефективність трансдукції ЛШ прямо пов’язана з тривалістю часу, протягом якого вектор залишається близько до клітин-мішеней, щоб забезпечити поглинання клітинами – «час перебування» 5, який легко скорочується типовим регіональним повітряним потоком, а також скоординованим поглинанням слизу та частинок MCT.Для муковісцидозу здатність подовжити час перебування ЛШ у дихальних шляхах важлива для досягнення високих рівнів трансдукції в цій області, але досі була складною.
Щоб подолати цю перешкоду, ми припускаємо, що магнітні частинки LV (MP) можуть допомогти двома додатковими способами.По-перше, їх можна направляти магнітом до поверхні дихальних шляхів, щоб покращити націлювання та допомогти частинкам-носіям генів перебувати в потрібній області дихальних шляхів;і ASL) переміщуються в клітинний шар 6. MP широко використовуються як засоби цільової доставки ліків, коли вони зв’язуються з антитілами, хіміотерапевтичними препаратами або іншими невеликими молекулами, які прикріплюються до клітинних мембран або зв’язуються з відповідними рецепторами клітинної поверхні та накопичуються в місцях пухлини. наявність статичної електрики.Магнітні поля для лікування раку 7. Інші «гіпертермічні» методи спрямовані на знищення пухлинних клітин шляхом нагрівання МП під дією коливальних магнітних полів.Принцип магнітної трансфекції, у якому магнітне поле використовується як агент трансфекції для посилення перенесення ДНК у клітини, зазвичай використовується in vitro з використанням ряду невірусних та вірусних генних векторів для складних для трансдукції клітинних ліній ..Встановлено ефективність магнітотрансфекції ЛШ з доставкою МП ЛШ in vitro в клітинну лінію епітелію бронхів людини в присутності статичного магнітного поля, що збільшило ефективність трансдукції в 186 разів порівняно з одним вектором ЛШ.МТ ЛШ також застосовували до моделі муковісцидозу in vitro, де магнітна трансфекція збільшувала трансдукцію ЛШ у культурах розділу повітря-рідина в 20 разів за наявності мокротиння муковісцидозу10.Проте магнітотрансфекції органів in vivo приділялося відносно мало уваги, і її оцінювали лише в кількох дослідженнях на тваринах11,12,13,14,15, особливо в легенях16,17.Однак можливості магнітної трансфекції в легеневій терапії при муковісцидозі очевидні.Тан та ін.(2020) заявив, що «дослідження ефективної легеневої доставки магнітних наночастинок прокладе шлях для майбутніх стратегій інгаляції CFTR для покращення клінічних результатів у пацієнтів з муковісцидозом»6.
Поведінку дрібних магнітних частинок на поверхні дихальних шляхів у присутності прикладеного магнітного поля важко візуалізувати та вивчити, і тому вони погано вивчені.В інших дослідженнях ми розробили метод фазово-контрастної рентгенівської візуалізації на основі синхротронного розповсюдження (PB-PCXI) для неінвазивної візуалізації та кількісної оцінки найменших in vivo змін глибини ASL18 і поведінки MCT19,20 для прямого вимірювання поверхневої гідратації газових каналів. і використовується як ранній індикатор ефективності лікування.Крім того, наш метод підрахунку MCT використовує частинки діаметром 10–35 мкм, що складаються з оксиду алюмінію або скла з високим показником заломлення, як маркери MCT, видимі за допомогою PB-PCXI21.Обидва методи придатні для візуалізації ряду типів частинок, включаючи MP.
Завдяки високій просторовій і часовій роздільній здатності наші аналізи ASL і MCT на основі PB-PCXI добре підходять для вивчення динаміки та моделей поведінки окремих і масових частинок in vivo, щоб допомогти нам зрозуміти й оптимізувати методи доставки генів MP.Підхід, який ми використовуємо тут, базується на наших дослідженнях з використанням лінії променя SPring-8 BL20B2, у якій ми візуалізували рух рідини після доставки дози фіктивного вектора в носові та легеневі дихальні шляхи мишей, щоб допомогти пояснити наші гетерогенні моделі експресії генів, що спостерігаються. в нашому ген.дослідження на тваринах з носійною дозою 3,4 .
Метою цього дослідження було використання синхротрона PB-PCXI для візуалізації in vivo рухів серії MP в трахеї живих щурів.Ці дослідження зображень PB-PCXI були розроблені, щоб перевірити серію MP, напруженість магнітного поля та розташування, щоб визначити їх вплив на рух MP.Ми припустили, що зовнішнє магнітне поле допоможе доставленому МП залишитися або переміститися до цільової області.Ці дослідження також дозволили нам визначити конфігурації магнітів, які максимізують кількість частинок, що залишаються в трахеї після осадження.У другій серії досліджень ми мали на меті використати цю оптимальну конфігурацію, щоб продемонструвати патерн трансдукції в результаті доставки in vivo LV-MPs у дихальні шляхи щурів, виходячи з припущення, що доставка LV-MPs у контексті націлювання на дихальні шляхи призведе до у підвищенні ефективності трансдукції ЛШ..
Усі дослідження на тваринах проводилися відповідно до протоколів, затверджених Університетом Аделаїди (M-2019-060 і M-2020-022) і Комітетом з етики тварин на синхротроні SPring-8.Експерименти проводилися відповідно до рекомендацій ARRIVE.
Усі рентгенівські зображення були зроблені на лінії променя BL20XU на синхротроні SPring-8 в Японії за допомогою установки, подібної до описаної раніше 21, 22.Коротко кажучи, експериментальний ящик знаходився в 245 м від накопичувача синхротрона.Відстань від зразка до детектора 0,6 м використовується для досліджень зображення частинок і 0,3 м для досліджень зображень in vivo для створення ефектів фазового контрасту.Використовувався монохроматичний пучок з енергією 25 кеВ.Зображення були отримані за допомогою рентгенівського датчика високої роздільної здатності (SPring-8 BM3), з’єднаного з детектором sCMOS.Перетворювач перетворює рентгенівське випромінювання у видиме світло за допомогою сцинтилятора товщиною 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12), який потім направляється на сенсор sCMOS за допомогою об’єктива мікроскопа ×10 (NA 0,3).Детектором sCMOS був Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Японія) з розміром масиву 2048 × 2048 пікселів і розміром необробленого пікселя 6,5 × 6,5 мкм.Цей параметр дає ефективний ізотропний розмір пікселя 0,51 мкм і поле зору приблизно 1,1 мм × 1,1 мм.Тривалість експозиції 100 мс була обрана для максимізації співвідношення сигнал/шум магнітних частинок усередині та поза дихальними шляхами, одночасно мінімізуючи артефакти руху, викликані диханням.Для досліджень in vivo швидкий рентгенівський затвор був розміщений на шляху рентгенівського випромінювання, щоб обмежити дозу випромінювання шляхом блокування рентгенівського променя між експозиціями.
Середовище LV не використовувалося в жодних дослідженнях візуалізації SPring-8 PB-PCXI, оскільки камера для візуалізації BL20XU не сертифікована за рівнем 2 біобезпеки.Замість цього ми вибрали низку добре охарактеризованих MP від ​​двох комерційних постачальників, що охоплюють діапазон розмірів, матеріалів, концентрацій заліза та застосувань — спочатку для того, щоб зрозуміти, як магнітні поля впливають на рух MP у скляних капілярах, а потім у живі дихальні шляхи.поверхні.Розмір МП коливається від 0,25 до 18 мкм і виготовляється з різних матеріалів (див. табл. 1), але склад кожного зразка, включаючи розмір магнітних частинок у МП, невідомий.Ґрунтуючись на наших обширних дослідженнях MCT 19, 20, 21, 23, 24, ми очікуємо, що MPs розміром до 5 мкм можна побачити на поверхні дихальних шляхів трахеї, наприклад, шляхом віднімання послідовних кадрів, щоб побачити покращену видимість руху MP.Один МП 0,25 мкм є меншим за роздільну здатність пристрою візуалізації, але PB-PCXI, як очікується, виявить їх об’ємний контраст і рух поверхні рідини, на якій вони осідають після нанесення.
Зразки для кожного депутата в табл.1 готували в 20 мкл скляних капілярах (Drummond Microcaps, PA, США) з внутрішнім діаметром 0,63 мм.Корпускулярні частинки доступні у воді, а частинки CombiMag доступні в фірмовій рідині виробника.Кожну пробірку наполовину заповнюють рідиною (приблизно 11 мкл) і встановлюють на тримач зразка (див. Малюнок 1).Скляні капіляри були розміщені горизонтально на столику в камері зображення, відповідно, і розташовані на краях рідини.До окрема таблиця передачі для досягнення дистанційної зміни вашого положення під час візуалізації.Рентгенівське зображення починається, коли магніт розташовується приблизно на 30 мм над зразком, і зображення отримують зі швидкістю 4 кадри в секунду.Під час візуалізації магніт наближався до скляної капілярної трубки (на відстань приблизно 1 мм), а потім переміщався вздовж трубки, щоб оцінити вплив напруженості поля та положення.
Установка візуалізації in vitro, що містить зразки MP у скляних капілярах на етапі трансляції зразка xy.Шлях рентгенівського променя позначено червоним пунктиром.
Після того, як була встановлена ​​видимість MP in vitro, їх підгрупу протестували in vivo на самках щурів-альбіносів Wistar дикого типу (віком ~12 тижнів, ~200 г).Медетомідин 0,24 мг/кг (Domitor®, Zenoaq, Японія), мідазолам 3,2 мг/кг (Dormicum®, Astellas Pharma, Японія) і буторфанол 4 мг/кг (Vetorphale®, Meiji Seika).Щурів анестезували сумішшю Pharma (Японія) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції.Після анестезії їх підготували до візуалізації, видаливши шерсть навколо трахеї, вставивши ендотрахеальну трубку (ET; внутрішньовенна канюля 16 Ga, Terumo BCT) і знерухомивши їх у положенні лежачи на виготовленій на замовлення пластині для візуалізації, що містить термосумку. підтримувати температуру тіла.22. Потім пластину для візуалізації прикріпили до столика для зразків у коробці для візуалізації під невеликим кутом, щоб вирівняти трахею горизонтально на рентгенівському зображенні, як показано на малюнку 2a.
(a) Налаштування візуалізації in vivo в блоці візуалізації SPring-8, шлях рентгенівського променя позначений червоною пунктирною лінією.(b, c) Локалізацію магніту трахеї проводили дистанційно за допомогою двох ортогонально встановлених IP-камер.У лівій частині зображення на екрані ви можете побачити дротяну петлю, що утримує головку, і канюлю доставки, встановлену всередині трубки ET.
Система шприцевого насоса з дистанційним керуванням (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) з використанням скляного шприца на 100 мкл була підключена до трубки PE10 (0,61 мм OD, 0,28 мм ID) за допомогою голки 30 Ga.Позначте трубку, щоб переконатися, що наконечник знаходиться в правильному положенні в трахеї під час введення ендотрахеальної трубки.Використовуючи мікронасос, поршень шприца видаляли, а кінчик пробірки занурювали в зразок МП, який потрібно доставити.Завантажену трубку для доставки потім вставляли в ендотрахеальну трубку, розміщуючи кінчик у найсильнішій частині нашого очікуваного прикладеного магнітного поля.Отримання зображення контролювалося за допомогою детектора дихання, підключеного до нашого блоку часу на основі Arduino, і всі сигнали (наприклад, температура, дихання, відкриття/закриття затвора та отримання зображення) були записані за допомогою Powerlab і LabChart (AD Instruments, Сідней, Австралія) 22 Під час візуалізації Коли корпус був недоступний, дві IP-камери (Panasonic BB-SC382) були розташовані приблизно під кутом 90° одна до одної та використовувалися для контролю положення магніту відносно трахеї під час візуалізації (Рис. 2b, c).Щоб мінімізувати артефакти руху, було отримано одне зображення на вдих під час кінцевого плато дихального потоку.
Магніт приєднаний до другого ступеня, який може бути розташований віддалено на зовнішній стороні зображення.Було протестовано різні положення та конфігурації магніту, в тому числі: розміщення під кутом приблизно 30° над трахеєю (конфігурації показано на малюнках 2а та 3а);один магніт над твариною, а інший нижче, з полюсами, встановленими для тяжіння (рис. 3b)., один магніт над твариною і один нижче, з полюсами, встановленими для відштовхування (Малюнок 3c), і один магніт над і перпендикулярно до трахеї (Малюнок 3d).Після встановлення тварини та магніту та завантаження досліджуваного МП у шприцевий насос доставте дозу 50 мкл зі швидкістю 4 мкл/с після отримання зображень.Потім магніт переміщають вперед і назад уздовж або впоперек трахеї, продовжуючи отримувати зображення.
Конфігурація магніту для візуалізації in vivo (a) один магніт над трахеєю під кутом приблизно 30°, (b) два магніти, налаштовані на притягання, (c) два магніти, налаштовані на відштовхування, (d) один магніт над і перпендикулярно до трахеї.Спостерігач дивився вниз від рота до легенів через трахею, і рентгенівський промінь проходив через лівий бік щура і виходив з правого боку.Магніт переміщують по довжині дихальних шляхів або вліво і вправо над трахеєю в напрямку рентгенівського променя.
Ми також намагалися визначити видимість і поведінку частинок у дихальних шляхах за відсутності змішування дихання та частоти серцевих скорочень.Таким чином, наприкінці періоду візуалізації тварин піддавали гуманній евтаназії через передозування пентобарбіталу (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, США; ~65 мг/кг внутрішньовенно).Деяких тварин залишали на платформі для візуалізації, і після припинення дихання та серцебиття процес візуалізації повторювали, додаючи додаткову дозу МП, якщо МП не було видно на поверхні дихальних шляхів.
Отримані зображення були скориговані для плоского та темного поля, а потім зібрані у фільм (20 кадрів на секунду; 15–25 × нормальна швидкість залежно від частоти дихання) за допомогою спеціального сценарію, написаного в MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Усі дослідження доставки вектора гена LV проводилися в Центрі лабораторних досліджень тварин Університету Аделаїди і мали на меті використовувати результати експерименту SPring-8 для оцінки того, чи може доставка LV-MP у присутності магнітного поля посилити перенесення генів in vivo .Для оцінки ефектів МП і магнітного поля було оброблено дві групи тварин: одній групі вводили МП ЛШ з розміщенням магніту, а іншій групі вводили МП ЛШ без магніту контрольній групі.
Генні вектори LV були створені за допомогою раніше описаних методів 25, 26.Вектор LacZ експресує локалізований у ядрі ген бета-галактозидази, керований конститутивним промотором MPSV (LV-LacZ), який виробляє синій продукт реакції в трансдукованих клітинах, видимих ​​на фронтах і зрізах легеневої тканини.Титрування проводили в клітинних культурах шляхом ручного підрахунку кількості LacZ-позитивних клітин за допомогою гемоцитометра для розрахунку титру в TU/мл.Носії кріоконсервують при -80°C, розморожують перед використанням і зв’язують із CombiMag шляхом змішування 1:1 та інкубують на льоду протягом принаймні 30 хвилин перед доставкою.
Нормальні щури Sprague Dawley (n = 3/групу, ~2-3 анестезованих внутрішньовенно із сумішшю 0,4 мг/кг медетомідину (Domitor, Ilium, Австралія) та 60 мг/кг кетаміну (Ilium, Австралія) у віці 1 місяця) ip ) ін’єкції та нехірургічні оральні канюлі за допомогою внутрішньовенної канюлі 16 Ga.Щоб переконатися, що тканина дихальних шляхів трахеї отримує трансдукцію ЛШ, її кондиціонували з використанням нашого раніше описаного протоколу механічної пертурбації, у якому поверхню дихальних шляхів трахеї натирали аксіально дротяним кошиком (N-Circle, екстрактор нітинолового каменю без наконечника NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, США) 30 стор.28.Потім, приблизно через 10 хвилин після пертурбації в біозахисту, проводили трахеальне введення ЛВ-МП.
Магнітне поле, яке використовувалося в цьому експерименті, було налаштовано подібно до рентгенівського дослідження in vivo, коли ті самі магніти утримувалися над трахеєю за допомогою затискачів для дистиляційних стентів (рис. 4).Об’єм 50 мкл (2 х 25 мкл аліквоти) LV-MP доставляли в трахею (n = 3 тварин) за допомогою піпетки з гелевим наконечником, як описано раніше.Контрольна група (n = 3 тварини) отримувала такий самий LV-MP без використання магніту.Після завершення інфузії канюлю виймають з ендотрахеальної трубки і тварину екстубують.Магніт залишається на місці протягом 10 хвилин перед видаленням.Щурам підшкірно вводили мелоксикам (1 мл/кг) (Ilium, Австралія) з наступною відміною анестезії шляхом внутрішньоочеревинної ін’єкції 1 мг/кг атипамазолу гідрохлориду (Antisedan, Zoetis, Австралія).Щурів тримали в теплі і спостерігали до повного виходу з анестезії.
Пристрій доставки LV-MP в шафі біологічної безпеки.Ви бачите, що світло-сірий наконечник Luer-lock трубки ET виступає з рота, а наконечник гелевої піпетки, показаний на малюнку, вставляється через трубку ET на потрібну глибину в трахею.
Через тиждень після процедури введення LV-MP тварин умертвляли гуманно шляхом інгаляції 100% CO2 і експресію LacZ оцінювали за допомогою нашого стандартного лікування X-gal.Три найбільш хвостових хрящових кільця були видалені, щоб гарантувати, що будь-які механічні пошкодження або затримка рідини внаслідок розміщення ендотрахеальної трубки не будуть включені в аналіз.Кожну трахею розрізали вздовж, щоб отримати дві половини для аналізу, і поміщали в чашку, що містить силіконовий каучук (Sylgard, Dow Inc), використовуючи голку Minutien (Fine Science Tools) для візуалізації поверхні просвіту.Розподіл і характер трансдукованих клітин підтверджено фронтальною фотографією за допомогою мікроскопа Nikon (SMZ1500) з камерою DigiLite і програмним забезпеченням TCapture (Tucsen Photonics, Китай).Зображення отримували з 20-кратним збільшенням (включно з максимальним налаштуванням для повної ширини трахеї), причому вся довжина трахеї відображалася крок за кроком, забезпечуючи достатнє перекриття між кожним зображенням, щоб зображення можна було «зшити».Зображення з кожної трахеї потім об’єднували в єдине складене зображення за допомогою редактора композитних зображень версії 2.0.3 (Microsoft Research) з використанням алгоритму планарного руху. Площа експресії LacZ у композитних зображеннях трахеї кожної тварини була кількісно визначена за допомогою автоматизованого сценарію MATLAB (R2020a, MathWorks), як описано раніше28, використовуючи налаштування 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 і Value < 0,7. Площа експресії LacZ у композитних зображеннях трахеї кожної тварини була кількісно визначена за допомогою автоматизованого сценарію MATLAB (R2020a, MathWorks), як описано раніше28, використовуючи налаштування 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 і Value < 0,7. Площадь експресії LacZ у складі зображень трахеїв від кожного тваринного була кількісно визначена з використанням значення автоматизованого сценарію MATLAB (R2020a, MathWorks), як описано раніше28, з використанням параметрів 0,35 <відтенок <0,58, насиченість> 0,15 і <0 ,7. Площа експресії LacZ у композитних зображеннях трахеї кожної тварини була кількісно визначена за допомогою автоматизованого сценарію MATLAB (R2020a, MathWorks), як описано раніше28, з використанням параметрів 0,350,15 і значення <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。 ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. Області експресії LacZ на складених зображеннях трахеї кожного тваринного кількості визначено з використанням автоматизованого сценарію MATLAB (R2020a, MathWorks), як описано раніше, з використанням налаштувань 0,35 <оттенок <0,58, насиченість> 0,15 і значення <0,7 . Ділянки експресії LacZ на складених зображеннях трахеї кожної тварини кількісно визначали за допомогою автоматизованого сценарію MATLAB (R2020a, MathWorks), як описано раніше, використовуючи параметри 0,35 < відтінок < 0,58, насиченість > 0,15 і значення < 0,7.Завдяки відстеженню контурів тканини в GIMP v2.10.24 для кожного складеного зображення вручну було створено маску, щоб визначити область тканини та запобігти будь-яким помилковим виявленням за межами тканини трахеї.Пофарбовані площі з усіх складених зображень кожної тварини були підсумовані, щоб отримати загальну пофарбовану площу для цієї тварини.Потім пофарбовану область розділили на загальну площу маски, щоб отримати нормалізовану площу.
Кожна трахея була занурена в парафін і нарізана товщиною 5 мкм.Зрізи фарбували нейтральним швидким червоним протягом 5 хвилин, а зображення отримували за допомогою мікроскопа Nikon Eclipse E400, камери DS-Fi3 і програмного забезпечення для захоплення елементів NIS (версія 5.20.00).
Усі статистичні аналізи проводили в GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Статистична значущість була встановлена ​​на р ≤ 0,05.Нормальність перевіряли за допомогою тесту Шапіро-Вілка, а відмінності у фарбуванні LacZ оцінювали за допомогою непарного t-тесту.
Шість MP, описаних у таблиці 1, були досліджені за допомогою PCXI, а видимість описана в таблиці 2. Два полістирольні MP (MP1 і MP2; 18 мкм і 0,25 мкм відповідно) не були видимі за допомогою PCXI, але решта зразків вдалося ідентифікувати. (приклади наведено на малюнку 5).MP3 і MP4 слабо помітні (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм і 0,9 мкм відповідно).Хоча MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) містив деякі з найдрібніших протестованих частинок, він був найбільш вираженим.Продукт CombiMag MP6 важко відрізнити.У всіх випадках наша здатність виявляти МП була значно покращена завдяки переміщенню магніту вперед і назад паралельно капіляру.Коли магніти віддалялися від капіляра, частинки витягувалися довгими ланцюжками, але коли магніти наближалися і напруженість магнітного поля збільшувалася, ланцюги частинок вкорочувалися, коли частинки мігрували до верхньої поверхні капіляра (див. Додаткове відео S1). : MP4), збільшуючи щільність частинок на поверхні.Навпаки, коли магніт видаляється з капіляра, напруженість поля зменшується, і МП перегруповуються в довгі ланцюжки, що простягаються від верхньої поверхні капіляра (див. Додаткове відео S2: MP4).Після припинення руху магніту частинки ще деякий час продовжують рухатися після досягнення положення рівноваги.У міру того, як MP рухається до верхньої поверхні капіляра та від неї, магнітні частинки намагаються втягнути сміття крізь рідину.
Видимість MP під PCXI значно відрізняється між зразками.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 і (d) MP6.Усі наведені тут зображення були зроблені за допомогою магніту, розташованого приблизно на 10 мм безпосередньо над капіляром.Уявні великі кола — це бульбашки повітря, захоплені капілярами, на яких чітко видно чорно-білі краї зображення фазового контрасту.Червона рамка вказує на збільшення, яке посилює контраст.Зверніть увагу, що діаметри ланцюгів магнітів на всіх малюнках не відповідають масштабу та приблизно в 100 разів більші, ніж показано.
У міру того, як магніт рухається вліво і вправо вздовж верхньої частини капіляра, кут струни MP змінюється, вирівнюючи його з магнітом (див. рис. 6), таким чином окреслюючи лінії магнітного поля.Для MP3-5 після того, як хорда досягає порогового кута, частинки тягнуться по верхній поверхні капіляра.Це часто призводить до групування MP у більші групи поблизу місця, де магнітне поле найсильніше (див. Додаткове відео S3: MP5).Це також особливо очевидно під час зображення поблизу кінця капіляра, що спричиняє агрегацію та концентрацію МП на межі рідина-повітря.Частинки в MP6, які було важче розрізнити, ніж у MP3-5, не тягнулися, коли магніт рухався вздовж капіляра, але струни MP дисоціювали, залишаючи частинки в полі зору (див. Додаткове відео S4: MP6).У деяких випадках, коли прикладене магнітне поле було зменшено шляхом переміщення магніту на велику відстань від місця отримання зображення, будь-які решта MP повільно опускалися на нижню поверхню труби під дією сили тяжіння, залишаючись у струні (див. Додаткове відео S5: MP3) .
Кут нахилу струни МП змінюється при русі магніту вправо над капіляром.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 і (d) MP6.Червона рамка вказує на збільшення, яке посилює контраст.Зауважте, що додаткові відео призначені для інформаційних цілей, оскільки вони розкривають важливу структуру частинок і динамічну інформацію, яку неможливо візуалізувати на цих статичних зображеннях.
Наші тести показали, що повільне переміщення магніту вперед-назад уздовж трахеї полегшує візуалізацію МП у контексті складного руху in vivo.Жодних тестів in vivo не проводили, оскільки кульки полістиролу (MP1 і MP2) не було видно в капілярі.Кожну з решти чотирьох MF тестували in vivo з довгою віссю магніту, розташованою над трахеєю під кутом приблизно 30° до вертикалі (див. малюнки 2b і 3a), оскільки це призводило до більш довгих ланцюгів MF і було більш ефективним. ніж магніт..налаштування припинено.MP3, MP4 і MP6 не були знайдені в трахеях будь-яких живих тварин.При візуалізації дихальних шляхів щурів після гуманного вбивства тварин частинки залишалися непомітними навіть при додаванні додаткового об’єму за допомогою шприцевого насоса.MP5 мав найвищий вміст оксиду заліза і був єдиною видимою частинкою, тому його використовували для оцінки та характеристики поведінки MP in vivo.
Розміщення магніту над трахеєю під час введення MF призвело до того, що багато, але не всі, MF були зосереджені в полі зору.Надходження частинок в трахею найкраще спостерігається у тварин, підданих гуманній евтаназії.Рисунок 7 і додаткове відео S6: MP5 показує швидке магнітне захоплення та вирівнювання частинок на поверхні вентральної трахеї, що вказує на те, що MP можна націлити на потрібні ділянки трахеї.При пошуку більш дистально вздовж трахеї після доставки MF деякі MF були знайдені ближче до киля, що вказує на недостатню напруженість магнітного поля для збору та утримання всіх MF, оскільки вони були доставлені через область максимальної напруженості магнітного поля під час введення рідини.процес.Однак постнатальні концентрації MP були вищими навколо області зображення, що свідчить про те, що багато MP залишалися в областях дихальних шляхів, де сила прикладеного магнітного поля була найвищою.
Зображення (а) до і (б) після доставки MP5 в трахею нещодавно евтаназованого щура з магнітом, розміщеним прямо над зоною зображення.Зображена ділянка розташована між двома хрящовими кільцями.У дихальних шляхах є трохи рідини перед доставкою МП.Червона рамка вказує на збільшення, яке посилює контраст.Ці зображення взяті з відео, представленого в S6: MP5 Supplementary Video.
Переміщення магніту вздовж трахеї in vivo призвело до зміни кута ланцюга MP на поверхні дихальних шляхів, подібно до того, що спостерігається в капілярах (див. Малюнок 8 і Додаткове відео S7: MP5).Однак у нашому дослідженні МП не можна було перетягувати по поверхні живих дихальних шляхів, як це могли робити капіляри.У деяких випадках ланцюг MP подовжується, коли магніт рухається вліво і вправо.Цікаво, що ми також виявили, що ланцюг частинок змінює глибину поверхневого шару рідини, коли магніт переміщується поздовжньо вздовж трахеї, і розширюється, коли магніт переміщується прямо над головою, а ланцюг частинок повертається у вертикальне положення (див. Додаткове відео S7).: MP5 на 0:09, внизу праворуч).Характерний малюнок руху змінювався, коли магніт переміщали латерально по верхній частині трахеї (тобто ліворуч або праворуч від тварини, а не вздовж трахеї).Частинки все ще було чітко видно під час їхнього руху, але коли магніт було видалено з трахеї, кінчики струн частинок стали видимими (див. Додаткове відео S8: MP5, починаючи з 0:08).Це узгоджується з спостережуваною поведінкою магнітного поля під дією прикладеного магнітного поля в скляному капілярі.
Зразки зображень, що демонструють MP5 у трахеї живого щура під наркозом.(a) Магніт використовується для отримання зображень вище та ліворуч від трахеї, а потім (b) після переміщення магніту праворуч.Червона рамка вказує на збільшення, яке посилює контраст.Ці зображення взято з відео, представленого в додатковому відео S7: MP5.
Коли два полюси були налаштовані в напрямку північ-південь вище та нижче трахеї (тобто притягуючись; рис. 3b), хорди МП виглядали довшими та були розташовані на латеральній стінці трахеї, а не на дорсальній поверхні трахеї. трахеї (див. додаток).Відео S9: MP5).Однак високі концентрації частинок в одному місці (тобто на дорсальній поверхні трахеї) не були виявлені після введення рідини за допомогою пристрою з подвійним магнітом, що зазвичай відбувається з пристроєм з одним магнітом.Потім, коли один магніт був налаштований на відштовхування протилежних полюсів (рис. 3c), кількість частинок, видимих ​​у полі зору, не збільшилася після доставки.Налаштувати обидві конфігурації магнітів складно через високу напруженість магнітного поля, яке притягує або штовхає магніти відповідно.Потім налаштування було змінено на єдиний магніт, паралельний дихальним шляхам, але проходив через дихальні шляхи під кутом 90 градусів, щоб силові лінії перетинали стінку трахеї ортогонально (рис. 3d), орієнтація, призначена для визначення можливості агрегації частинок на бічну стінку.спостерігатися.Однак у цій конфігурації не було ідентифікованого руху накопичення MF або руху магніту.На основі всіх цих результатів була обрана конфігурація з одним магнітом і 30-градусною орієнтацією для досліджень носіїв генів in vivo (рис. 3а).
Коли тварину знімали кілька разів відразу після того, як її принесли в жертву людиною, відсутність заважаючих рухів тканин означала, що в чіткому міжхрящовому полі можна було розрізнити більш тонкі, короткі лінії частинок, які «гойдалися» відповідно до поступального руху магніту.чітко бачити присутність і рух частинок MP6.
Титр LV-LacZ становив 1,8 x 108 МО/мл, і після змішування 1:1 з CombiMag MP (MP6) тваринам вводили 50 мкл трахеальної дози 9 x 107 МО/мл носія LV (тобто 4,5 x 106 TU/щур).).).У цих дослідженнях замість переміщення магніту під час пологів ми зафіксували магніт в одному положенні, щоб визначити, чи можна (а) покращити трансдукцію ЛШ порівняно з векторною поставкою за відсутності магнітного поля та (б) чи можна дихальні шляхи бути зосередженим.Клітини трансдукуються в магнітних цільових областях верхніх дихальних шляхів.
Наявність магнітів і використання CombiMag у поєднанні з векторами ЛШ не вплинули негативно на здоров’я тварин, як і наш стандартний протокол доставки вектора ЛШ.Фронтальні зображення області трахеї, підданої механічним збуренням (додаткова рис. 1), показали, що група, яка отримувала LV-MP, мала значно вищі рівні трансдукції в присутності магніту (рис. 9a).Лише невелика кількість синього фарбування LacZ була присутня в контрольній групі (рис. 9b).Кількісне визначення нормалізованих ділянок, пофарбованих X-Gal, показало, що введення LV-MP у присутності магнітного поля призвело до приблизно 6-кратного покращення (рис. 9c).
Приклад складених зображень, що демонструють трансдукцію трахеї за допомогою LV-MP (a) у присутності магнітного поля та (b) за відсутності магніту.(c) Статистично значуще покращення нормалізованої області трансдукції LacZ у трахеї з використанням магніту (*p = 0,029, t-тест, n = 3 на групу, середнє ± стандартна помилка середнього).
Нейтральні швидко пофарбовані в червоний зрізи (приклад показаний на Додатковому малюнку 2) вказують на те, що клітини, пофарбовані LacZ, присутні в тому самому зразку та в тому самому місці, як повідомлялося раніше.
Ключовою проблемою в генній терапії дихальних шляхів залишається точна локалізація частинок-носіїв у зацікавлених областях і досягнення високого рівня ефективності трансдукції в рухомій легені за наявності повітряного потоку та активного очищення слизу.Для носіїв LV, призначених для лікування респіраторних захворювань при муковісцидозі, збільшення часу перебування частинок носія в провідних дихальних шляхах досі було недосяжною метою.Як зазначають Кастеллані та ін., використання магнітних полів для посилення трансдукції має переваги перед іншими методами доставки генів, такими як електропорація, оскільки воно може поєднувати простоту, економію, локалізовану доставку, підвищену ефективність і коротший час інкубації.і, можливо, меншу дозу носія10.Однак осадження in vivo та поведінка магнітних частинок у дихальних шляхах під впливом зовнішніх магнітних сил ніколи не були описані, і фактично здатність цього методу підвищувати рівні експресії генів у неушкоджених живих дихальних шляхах не була продемонстрована in vivo.
Наші експерименти in vitro на синхротроні PCXI показали, що всі частинки, які ми перевіряли, за винятком полістиролу MP, були видимі в установці зображення, яку ми використовували.У присутності магнітного поля магнітні поля утворюють струни, довжина яких пов’язана з типом частинок і силою магнітного поля (тобто близькості та руху магніту).Як показано на малюнку 10, струни, які ми спостерігаємо, утворюються, коли кожна окрема частинка намагнічується та індукує власне локальне магнітне поле.Ці окремі поля змушують інші подібні частинки збиратися та з’єднуватися з груповими рухами струн завдяки локальним силам місцевих сил притягання та відштовхування інших частинок.
На діаграмі показано (а, б) ланцюги частинок, що утворюються всередині заповнених рідиною капілярів, і (в, г) заповнену повітрям трахею.Зауважте, що капіляри та трахея намальовані не в масштабі.Панель (а) також містить опис МП, що містить частинки Fe3O4, розташовані в ланцюги.
Коли магніт рухався над капіляром, кут струни частинок досягав критичного порогу для MP3-5, що містить Fe3O4, після чого струна частинок більше не залишалася у вихідному положенні, а рухалася по поверхні в нове положення.магніт.Цей ефект, імовірно, виникає тому, що поверхня скляного капіляра досить гладка, щоб дозволити цей рух.Цікаво, що MP6 (CombiMag) не поводився таким чином, можливо, через те, що частинки були меншими, мали інше покриття чи поверхневий заряд, або запатентована рідина-носій впливала на їх здатність рухатися.Контраст на зображенні частинок CombiMag також слабший, що свідчить про те, що рідина та частинки можуть мати однакову щільність і тому не можуть легко рухатися одна до одної.Частинки також можуть застрягти, якщо магніт рухається надто швидко, що вказує на те, що напруженість магнітного поля не завжди може подолати тертя між частинками в рідині, припускаючи, що напруженість магнітного поля та відстань між магнітом і цільовою областю не повинні бути як сюрприз.важливо.Ці результати також вказують на те, що хоча магніти можуть захоплювати багато мікрочастинок, що протікають через цільову область, малоймовірно, що магніти можуть переміщувати частинки CombiMag по поверхні трахеї.Таким чином, ми дійшли висновку, що дослідження МП ЛШ in vivo повинні використовувати статичні магнітні поля для фізичного націлювання на певні ділянки дерева дихальних шляхів.
Після того, як частинки потрапляють в організм, їх важко ідентифікувати в контексті складної рухомої тканини тіла, але їх здатність виявлення було покращено завдяки переміщенню магніту горизонтально над трахеєю, щоб «ворушити» струни MP.Хоча зображення в реальному часі можливе, легше розпізнати рух частинок після того, як тварина була вбита гуманним шляхом.Концентрації MP зазвичай були найвищими в цьому місці, коли магніт розміщувався над зоною зображення, хоча деякі частинки зазвичай виявлялися далі в трахеї.На відміну від досліджень in vitro, частинки не можуть затягнутися в трахею за допомогою руху магніту.Цей висновок узгоджується з тим, як слиз, який покриває поверхню трахеї, зазвичай обробляє вдихувані частинки, захоплюючи їх у слиз і згодом очищаючи їх за допомогою механізму мукоциліарного кліренсу.
Ми припустили, що використання магнітів над і під трахеєю для притягання (рис. 3b) може призвести до більш рівномірного магнітного поля, а не магнітного поля, яке сильно концентрується в одній точці, потенційно призводячи до більш рівномірного розподілу частинок..Однак наше попереднє дослідження не знайшло чітких доказів на підтримку цієї гіпотези.Подібним чином встановлення пари магнітів на відштовхування (рис. 3c) не призвело до більшого осідання частинок у зоні зображення.Ці два висновки демонструють, що установка з подвійним магнітом суттєво не покращує локальний контроль наведення MP, і що результуючі сильні магнітні сили важко налаштувати, що робить цей підхід менш практичним.Подібним чином орієнтація магніту над і впоперек трахеї (рис. 3d) також не призвела до збільшення кількості частинок, що залишилися в зоні зображення.Деякі з цих альтернативних конфігурацій можуть бути невдалими, оскільки призводять до зменшення напруженості магнітного поля в зоні осадження.Таким чином, конфігурація одного магніту під кутом 30 градусів (рис. 3а) вважається найпростішим і найефективнішим методом тестування in vivo.
Дослідження LV-MP показало, що коли вектори LV поєднували з CombiMag і доставляли після фізичного впливу в присутності магнітного поля, рівень трансдукції значно збільшувався в трахеї порівняно з контролем.На основі досліджень синхротронної візуалізації та результатів LacZ виявилося, що магнітне поле здатне утримувати ЛШ у трахеї та зменшувати кількість векторних частинок, які негайно проникають глибоко в легені.Такі покращення націлювання можуть призвести до підвищення ефективності, одночасно зменшуючи доставлені титри, нецільову трансдукцію, запальні та імунні побічні ефекти та витрати на перенесення генів.Важливо, що, за словами виробника, CombiMag можна використовувати в поєднанні з іншими методами перенесення генів, включаючи інші вірусні вектори (наприклад, AAV) і нуклеїнові кислоти.