Giardia duodenum є паразитичним організмом, який викликає лямбліоз, кишкову інфекцію, яка особливо поширена у маленьких дітей із клінічними ознаками діареї.Раніше ми повідомляли, що позаклітинний G. duodenalis запускає активацію нуклеотидів, що зв’язують внутрішньоклітинний олігомеризаційний рецептор 3 (NLRP3), і регулює запальні реакції господаря через секрецію позаклітинних везикул (EV).Однак точні молекулярні структури асоційованого з патогеном дуоденококового EV (GEV), залученого в цей процес, і роль інфламмасоми NLRP3 у лямбліозі ще не з’ясовані.
Рекомбінантні еукаріотичні експресійні плазміди pcDNA3.1(+)-альфа-2 і альфа-7.3 гіардини в GEV були сконструйовані, трансфіковані в первинні перитонеальні макрофаги миші та виявлені шляхом вимірювання молекули-мішені запалення каспази-1.Рівень експресії р20 перевіряли..G. duodenalis alpha-2 і alpha-7.3 giardines були спочатку ідентифіковані шляхом вимірювання NLRP3 inflammasome (NLRP3, про-інтерлейкін-1 бета [IL-1β], про-каспаза-1 і каспаза-1 p20), секреція IL.рівні 1β, рівні олігомеризації апоптотичного плямистого білка (ASC) і імунофлуоресцентна локалізація NLRP3 і ASC.Роль інфламмасоми NLRP3 у патогенності G. duodenalis потім оцінювали з використанням мишей, у яких активація NLRP3 була заблокована (миші з блокуванням NLRP3), і спостерігали за патологічними змінами маси тіла, дуоденального паразитарного навантаження та дуоденальної тканини.Крім того, ми досліджували, чи індукують гіардини альфа-2 і альфа-7.3 секрецію IL-1β in vivo через інфламмасому NLRP3, і визначили роль цих молекул у патогенності G. duodenalis у мишей.
Альфа-2 і альфа-7.3 гіардини індукують активацію інфламмасоми NLRP3 in vitro.Це призвело до активації p20 каспази-1, підвищення рівня експресії білків NLRP3, pro-IL-1β і pro-caspase-1, значного збільшення секреції IL-1β, утворення плям ASA в цитоплазми та індукції олігомеризації ASA.Запалення NLRP3 Втрата статевого члена посилює патогенність G. duodenalis у мишей.У мишей, які отримували лікування кіст за допомогою зонда від мишей, заблокованих NLRP3, виявлено підвищену кількість трофозоїтів і серйозне пошкодження ворсинок дванадцятипалої кишки, що характеризується некротичними криптами зі зморщеними та розгалуженими.Експерименти in vivo показали, що giardines альфа-2 і альфа-7.3 можуть індукувати секрецію IL-1β через інфламмасому NLRP3, а імунізація giardines альфа-2 і альфа-7.3 знижує патогенність G. duodenalis у мишей.
У сукупності результати цього дослідження свідчать про те, що лямблії альфа-2 і альфа-7.3 викликають регуляцію запалення NLRP3 господаря та знижують інфекційність G. duodenalis у мишей, які є перспективними мішенями для запобігання лямбліозу.
Giardia duodenum є позаклітинним найпростішим паразитом, який живе в тонкій кишці та викликає 280 мільйонів випадків лямбліозу з діареєю щорічно, особливо серед маленьких дітей у країнах, що розвиваються [1].Люди заражаються, вживаючи воду або їжу, заражену цистами M. duodenum, які потім потрапляють у шлунок і виділяються разом із шлунковим соком.Трофозоїти Giardia duodenum прикріплюються до епітелію дванадцятипалої кишки, викликаючи нудоту, блювоту, діарею, біль у животі та втрату ваги.Особи з імунодефіцитом і муковісцидозом сприйнятливі до інфекції.Зараження також можливе при оральному та анальному сексі [2].Такі препарати, як метронідазол, тинідазол і нітазоксанід, є кращими варіантами лікування інфекцій дванадцятипалої кишки [3].Однак ці хіміотерапевтичні препарати викликають побічні ефекти, такі як нудота, канцерогенез і генотоксичність [4].Тому необхідно розробити більш ефективні стратегії для запобігання інфекції G. duodenalis.
Інфламмасоми — це клас цитозольних білкових комплексів, які є частиною вродженої імунної відповіді, допомагаючи захищатися від інвазії патогенів і опосередковуючи запальні відповіді [5].Серед цих інфламмасом нуклеотид-зв’язуюча олігомеризація (NOD) рецептор 3 (NLRP3) нуклеотид-зв’язуюча олігомеризація (NLRP3) подібна до нуклеотид-зв’язування інфламмасома була широко вивчена, оскільки її можна виявити різними молекулярними структурами, пов’язаними з патогеном/пошкодженням (PAMP/ DAMP), розпізнає, активує вроджену імунну систему.і регулює кишковий гомеостаз при багатьох запальних захворюваннях [6,7,8].Він складається з рецептора розпізнавання образів (PRR) NLRP3, адаптерного апоптотичного плямистого білка (ASC) і ефектора прокаспази-1 або прокаспази-11.Інфламмасома NLRP3 діє як господар проти інвазії патогенів, як спостерігалося в дослідженнях Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] і Leishmania.[11], але також повідомлялося, що активація інфламмасоми NLRP3 обмежує захисні імунні відповіді та загострює прогресування захворювання, наприклад, у глистів [12].На підставі наших попередніх висновків ми повідомили, що позаклітинний G. duodenalis викликає внутрішньоклітинну активацію запалення NLRP3 і модулює запальні реакції господаря шляхом секреції позаклітинних везикул (EV) [13].Однак роль інфламмасоми NLRP3 в інфекції G. duodenalis in vivo ще належить визначити.
Giardins спочатку були описані як структурні компоненти цитоскелета G. duodenalis і відіграють важливу роль у рухливості трофозоїтів і прикріпленні епітеліальних клітин у тонкій кишці.Для кращої адаптації до середовища та підвищення їх патогенності трофозоїти G. duodenalis розвинули унікальну цитоскелетну структуру, яка складається з 8 джгутиків, 1 середнього тіла та 1 вентрального диска [14].Трофозоїти Giardia duodenum використовують свій цитоскелет, щоб проникнути у верхній відділ тонкої кишки, особливо в дванадцятипалу кишку, і прикріпитися до ентероцитів.Вони постійно мігрують і прикріплюються до епітеліальних клітин за допомогою клітинного метаболізму.Тому існує тісний зв'язок між їх цитоскелетом і вірулентністю.Жиардини, специфічні для Giardia duodenum, є компонентами структури цитоскелету [15] і поділяються на чотири класи: α-, β-, γ- та δ-гіардини.Існує 21 член сімейства α-гіардінів, усі з яких мають залежну від кальцію здатність зв’язувати фосфоліпіди [16].Вони також з’єднують цитоскелет з клітинною мембраною.В осіб із діареєю, спричиненою G. duodenalis, α-гіардини мають високу експресію та імунореактивність під час інфекції [17].Гетерологічні вакцини на основі лямблій альфа-1 захищали від лямбліозу у мишей і є потенційними антигенами-кандидатами для розробки вакцин [18].Альфа-8 гіардін, локалізований у плазматичній мембрані та джгутиках, але не у вентральному диску, посилює рухливість та швидкість росту трофозоїтів у G. duodenalis [19].Альфа-14 гіардін прикріплюється до структур мікротрубочок на джгутиках і впливає на життєздатність G. duodenalis [20].Альфа-11 гіардін присутній у великій кількості протягом усього життєвого циклу, і надмірна експресія альфа-11 гіардін пошкоджує сам G. duodenalis [21].Однак незрозуміло, чи альфа-2 гіардін і альфа-7.3 гіардін захищають від інфекції G. duodenalis і механізмів, що лежать в їх основі.
У цьому дослідженні рекомбінантні еукаріотичні експресійні плазміди pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine трансфікували в первинні перитонеальні макрофаги миші для активації NLRP3 господаря.Потім проводили скринінг інфламмасомних мішеней.Ми також оцінили роль інфламмасоми NLRP3 у патогенності G. duodenalis, дослідили, чи індукують альфа-2 та альфа-7,3 гіардини активацію інфламмасоми NLRP3 in vivo, і визначили, що ці дві ролі гіардин у патогенності G. duodenalis.Нашою спільною метою була розробка перспективних мішеней для профілактики інфекції G. duodenalis.
Самки мишей дикого типу (WT) C57BL/6 віком 5–8 тижнів були придбані в Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Ляонін, Китай).Миші мали вільний доступ до води, отримували стерилізовану їжу та містилися в 12/12-годинному циклі світло/темрява.Перед зараженням миші отримували антибіотики ad libitum у питній воді з додаванням ампіциліну (1 мг/мл), ванкоміцину (1 мг/мл) і неоміцину (1,4 мг/мл) (усі придбані в Шанхаї, Китай, штучні організми) [ 22 ].].Мишей, які втратили здатність їсти і пити більше 24 годин і втратили ≥ 20% маси тіла, піддавали гуманній евтаназії шляхом вивиху шийки матки.
Трофозоїти WB G. duodenalis (Американська колекція типових культур, Манассас, США) доповнювали 12,5% фетальної бичачої сироватки (FBS; Every Green, Zhejiang, Китай) і 0,1% бичачої жовчі (Sigma-Aldrich, St. Missouri, США). ).США) в мікроаеробних умовах.Конфлюентні трофозоїти збирали на лід і пасажували у співвідношенні 1:4 для подальшого розмноження.
Кісти лямблій дванадцятипалої кишки індукували, як описано раніше [23], трофозоїти збирали в логарифмічній фазі, а потім розбавляли інкапсуляційним середовищем, рН 7,1 (модифікований TYI-S-33) до кінцевої концентрації 1 × 106 трофозоїтів/мл.концентрація жовчі 0,05% середня).Трофозоїти культивували в анаеробних умовах при 37°C до фази логарифмічного росту.Змініть середовище на середовище для індукції цист (рН 7,8; ​​модифіковане середовище TYI-S-33 з 1% концентрацією жовчі) і культивуйте G. duodenalis при 37 °C протягом 48–96 годин, протягом яких утворення цист спостерігали під мікроскопом.Після того, як більшість трофозоїтів спричинили утворення цист, культуральну суміш збирали та ресуспендували в стерильній деіонізованій воді для лізису решти трофозоїтів.Цисти підраховували та зберігали при 4°C для наступних аналізів через шлунковий зонд у мишей.
Позаклітинні везикули лямблій (GEV) були збагачені, як описано раніше [13].Трофозоїти в логарифмічній фазі росту ресуспендували в модифікованому середовищі TYI-S-33, приготовленому з FBS з виснаженим екзосомами (Biological Industries, Бейт-Хаемек, Ізраїль) до кінцевої концентрації 1 × 106 паразитів/мл та інкубували протягом 12 годин.виділяли з супернатанту культури центрифугуванням при 2000 g протягом 10 хв, 10 000 g протягом 45 хв і 100 000 g протягом 60 хв.Осади розчиняли у фосфатно-сольовому буфері (PBS), кількісно визначали за допомогою набору для аналізу білка BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) і зберігали при -80°C або використовували безпосередньо для подальших аналізів.
Первинні перитонеальні макрофаги миші готували, як описано раніше [24].Коротко, мишам (віком 6-8 тижнів) вводили (внутрішньочеревно [ip]) 2,5 мл 2,98% рідкого тіогліколевого середовища Difco (BD, Франклін Лейкс, Нью-Джерсі, США) і годували 3-4 піднебіння.З черевної порожнини мишей після евтаназії збирали суспензію макрофагів і центрифугували 3 рази при 1000 g протягом 10 хв.Зібрані клітини виявляли за допомогою проточної цитометрії з використанням маркера CD11b, поки чистота клітин не становила >98%, потім додавали до 6-лункових планшетів для культури клітин (4,5 x 106 клітин/лунка) та інкубували з 10% FBS (Bioindustry) при 37°C.і 5% CO2.
РНК екстрагували з 1 × 107 трофозоїтів в 1 мл реагенту TRIzol (Vazyme, Nanjing, Китай), геномну ДНК екстрагували з тотальної РНК G. duodenalis за допомогою MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) і синтезували комплементарну ДНК (кДНК). за допомогою MonScript RTIIII Super Mix (Monad) відповідно до інструкцій виробника.
Інформація про послідовність CDS для цільового гена G. duodenalis була отримана з NCBI GenBank.Використовуйте Primer 5.0 для створення конкретних праймерів безшовного клонування для кожного цільового гена.Прямий праймер (5′-3′) складається з трьох частин: послідовності, що перекривається, з лінеаризованим вектором pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) і стартовими кодонами ATG і GNN (якщо перша основа не є G).Це робиться для підвищення ефективності вираження.Крім того, щонайменше 16 bp комбінованих основ (вміст GC 40–60%/Tm приблизно 55 °C).Зворотний праймер (5′-3′) складається з двох частин, послідовності, що перекривається, з EcoRV-лінеаризованим вектором pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) і комбінованої основи щонайменше 16 bp.(без останніх двох зупинок).основи) кодон, такий як AA або GA, щоб дозволити рекомбінантним плазмідам експресувати свої мічені білки).Послідовності праймерів наведені в таблиці 1 і були синтезовані Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Чанчунь, Китай).
Мішені ампліфікували за допомогою ДНК-полімерази Pfu (Tiangen, Пекін, Китай) або Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Пекін, Китай), використовуючи готову кДНК G. duodenalis як матрицю.Плазміду еукаріотичного вектора експресії pcDNA3.1(+) лінеаризували рестриктазою EcoRV і дефосфорилювали за допомогою Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Лінеаризовані фрагменти pcDNA3.1(+) та ампліфіковані фрагменти цільового гена очищали за допомогою набору для очищення ДНК у гелі (Tiangen) і кількісно визначали за допомогою Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Фрагмент pcDNA3.1(+) і кожний фрагмент цільового гена були рекомбіновані за допомогою суміші для клонування однієї збірки MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Сучжоу, Китай) і підтверджені секвенуванням ДНК за допомогою Comate Bioscience Company Limited (Чанчунь, Китай)..
Плазміди без ендотоксинів pcDNA3.1(+)-alpha-2 і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 були створені за допомогою міні-набору SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Концентрацію підтримували вище 500 нг/мкл, щоб гарантувати, що ЕДТА в буфері для елюції не заважає аналізу трансфекції.Первинні перитонеальні макрофаги миші культивували в 6-лункових планшетах із повним середовищем RPMI 1640 (Biological Industries) протягом 12 годин, потім клітини промивали 3 рази теплим PBS для видалення пеніциліну та стрептоміцину, а потім у середовищі, доповненому повним середовищем.Вільні від ендотоксину плазміди pcDNA3.1(+)-alpha-2 і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 мкг) розводили в 125 мкл середовища Opti-MEM зі зниженим вмістом сироватки (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Потім 5 мкл реагенту для трансфекції Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) розводили в 125 мкл середовища Opti-MEM з низьким вмістом сироватки.Приготуйте комплекси ліпосома-ДНК, змішавши розведену вільну від ендотоксинів плазміду з Lipofectamine 2000 і давши суміші постояти при кімнатній температурі протягом 5 хвилин.Перенесіть комплекси окремо в комірки кожної лунки та повільно перемішайте.Через 4 години культуральне середовище клітин замінювали 2 мл повного середовища RPMI 1640 і культивування продовжували протягом 24 годин.Свіже культуральне середовище клітин додавали до клітин та інкубували протягом різних часових проміжків залежно від плану аналізу.
Зразки білка з супернатантів і клітинних лізатів готували, як описано раніше [25].Параметри мембранного переносу для про-IL-1β, про-каспази-1, каспази-1 p20, NLRP3, β-актину та His-мітки становили 200 мА/90 хв.Для інтерлейкіну 1β (IL-1β; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США), каспази-1 (p20) (Adipogen, Швейцарія) і NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Швейцарія) і 1:5000, націлених на тег His (Amylet Scientific, Ухань, Китай) і β-актин (Proteintech, Ухань, Китай).
Перехресне зшивання дисукцинімід субератом (DSS) проводили, як описано раніше [26].Клітини промивали 3 рази холодним PBS і повністю лізували голкою 27 калібру в 50 мкл реакційного буфера ASC (pH 8,0), що містив 25 мМ Na2PO4, 187,5 мМ NaCl, 25 мМ HEPES і 125 мМ NaHCO3.Суміш центрифугували при 5000 g протягом 3 хвилин і осад зшивали 10 мкл DSS (25 мМ в ДМСО) і 40 мкл реакційного буфера ASC протягом 30 хвилин при 37°C.Після центрифугування при 5000 g протягом 10 хв осад розчиняли в розчині 40 мкл реакційного буфера ASC і 10 мкл 6x буфера для завантаження білка (TransGen, Пекін, Китай), а потім розчин гасили при кімнатній температурі протягом 15 хв., Потім кип'ятити 10 хвилин.Потім зразки білка піддавали вестерн-блоттингу з використанням первинних антитіл проти ASC (Wanleibio, Shenyang, China) у співвідношенні розведення 1:500.
Дотримуючись описаної раніше процедури [13], збирали супернатанти клітинної культури та визначали секрецію прозапального цитокіну IL-1β за допомогою набору для ELISA IL-1 Beta (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Перетворіть значення OD450nm у концентрації білка за допомогою стандартної кривої IL-1β.
Клітини, покриті покривними скельцями, обережно промивали 3 рази теплим PBS, фіксували у фіксаторі тканинних клітин (Biosharp, Пекін, Китай) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі (RT), у 0,1% Triton X-Permeabilize при 100 (розведеному в PBS; Biosharp ) протягом 20 хвилин при кімнатній температурі та блокуйте в 5% бичачому сироватковому альбуміні (у PBS) протягом 2 годин при кімнатній температурі.Потім клітини інкубували протягом ночі при 4°C з первинними антитілами проти ASC (розведення 1:100) або NLRP3 (розведення 1:100), відповідно, і Cy3-міченими козячими анти-кролячими IgG(H+L) (1:400; EarthOx). , Сан-Франциско, Каліфорнія, США) або FITC-кон’югований козячий антимишачий IgG (1:400; Earthox) протягом ночі при 37°C у темряві протягом 1 години.Ядра фарбували Hoechst 33258 (10 мкг/мл; UE, Сучжоу, Китай) протягом 5 хвилин і спостерігали під флуоресцентним мікроскопом (Olympus Corporation, Токіо, Японія).
Мишей розділили на чотири групи (n = 7 у кожній групі): (i) група негативного контролю, оброблена PBS (тільки PBS; введення через зонд 100 мкл/мишу PBS з наступною щоденною внутрішньоочеревинною ін’єкцією 100 мкл/миші PBS через 3 години)., безперервно протягом 7 днів);(ii) негативна контрольна група, яка отримувала інгібітор MCC950 [27] (100 мкл/мишу через зонд PBS, через 3 години, 10 мг/кг маси тіла [BW] MCC950 [в PBS] вводили внутрішньоочеревинно щодня, тривалість 7 днів);(iii) група інфікування кістою G. duodenalis (1,5 х 106 цист/мишу через зонд, через 3 години, 100 мкл/мишу PBS внутрішньочеревно вводити щодня протягом 7 днів);(iv) Група комбінованої інфекції кісти G. duodenalis, яка отримувала інгібітор MCC950 (1,5 × 106 цист/мишу через зонд, 10 мг/кг маси тіла MCC950 внутрішньочеревно щодня протягом 7 днів через 3 години).Масу тіла кожної миші контролювали щодня, і всіх мишей піддавали евтаназії на 7-й день.Зібрану дванадцятипалу кишку (3 см завдовжки) розрізали на дрібні шматочки в 1 мл PBS, цисти знищували протягом ночі в PBS при 4°C і трофозоїти G. duodenalis.Свіжу дванадцятипалу кишку (довжиною 1 см) виділяли для фарбування гематоксиліном та еозином (H&E).
Мишей розділили на дві групи: (i) контрольну групу MOCK і (ii) групу інгібітора MCC950.У кожній групі було п’ять варіантів лікування (n = 7/групу лікування): (i) негативна контрольна група лікування PBS (тільки PBS; 100 мкл/миша PBS, внутрішньом’язова ін’єкція (передня великогомілкова кістка) [28, 29] ;( ii) група негативного контролю за плазмідою pcDNA3.1(+) (100 мкг/ДНК миші, шляхом внутрішньом’язової ін’єкції) (iii) група позитивного контролю за інфекцією кісти G. duodenalis (1,5 x 106 цист/миша, через зонд) (iv) a група, оброблена плазмідою pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 мкг/миша ДНК, шляхом внутрішньом’язової ін’єкції), і (v) група, оброблена плазмідою pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 мкг/миша ДНК, після 12 годин пасажу миші в групі інгібітора MCC950 отримували щоденну внутрішньочеревну ін’єкцію MCC950 (10 мг/кг маси тіла) протягом 7 днів, тоді як миші в групі MOCK отримували рівний об’єм PBS. Зразки крові були Зразки сироватки, зібрані з очних яблук мишей і залишені на ніч при 4 °C, виділяли за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) для вимірювання рівнів IL-1β.
Тридцять п'ять мишей розділили на п'ять груп (n=7/групу).Група 1 була негативною контрольною групою, яку лікували PBS: миші отримували 100 мкл PBS внутрішньом’язово і через 3 дні через зонд.Група 2 — це група позитивного контролю, інфікована цистами G. duodenalis: мишам вводили 100 мкл PBS, а через 3 дні внутрішньошлунково вводили 1,5 × 106 цист/мишу.Третя група – імунізація плазмідою pcDNA3.1(+) у поєднанні з контрольною групою при дуоденальній кісті: миші отримували 100 мкг плазмідної ДНК pcDNA3.1(+)(im) перорально, 1,5×106 цист/мишу 3 протягом декількох днів. днів.Групи 4 і 5 являли собою рекомбінантну плазміду pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або плазміду pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine у ​​поєднанні з інфекцією кісти G. duodenalis.Експериментальна група: миші отримували 100 мкг pcDNA3.1(+)-giardine плазмідної ДНК (im), потім через 3 дні, 1,5 × 106 цист/мишу вводили через зонд.Масу тіла кожної миші контролювали після введення цисти G. duodenalis через трубку.Свіжу дванадцятипалу кишку збирали для вимірювання паразитарного навантаження та аналізу фарбування HE.
Гістопатологічні зміни аналізували згідно з раніше опублікованою процедурою [30].Свіжу дванадцятипалу кишку фіксували фіксатором тканинних клітин, заливали в парафін, розрізали на зрізи 4 мкм, фарбували H&E і аналізували під світловим мікроскопом.Репрезентативні патологічні зміни в семи зрізах тканини семи незалежних мишей були оцінені патологом, який не знав про лікування, і були зафіксовані при 200-кратному збільшенні.Довжину ворсинок і глибину крипт вимірювали відповідно до описаних раніше методів.
Результати in vitro та in vivo були отримані в трьох повторах.Графіки були створені за допомогою GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, США).Відмінності між двома групами аналізували за допомогою t-тесту, тоді як відмінності між групами ≥3 аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з використанням програмного забезпечення SPSS (версія 22.0; SPSS IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США).Дані були проаналізовані на однорідність дисперсії з використанням критерію Левена з наступним тестом Бонферроні (B).Значущість виражається як P<0,05, P<0,01 і P<0,001 (незначно [нс]) (P>0,05).
Наш попередній аналіз протеоміки GEV у Кіотській енциклопедії генів і геномів (KEGG) показав, що багато мішеней можуть брати участь в активації запальних сигнальних шляхів [13].Ми вибрали дві багатообіцяючі мішені, альфа-2 та альфа-7.3 гіардини, ампліфікували ці молекули та використовували їх для конструювання еукаріотичного вектора експресії pcDNA3.1(+).Після секвенування рекомбінантні плазміди експресії pcDNA3.1(+)-alpha-2 та alpha-7.3 giardine трансфікували в первинні перитонеальні макрофаги миші та ідентифікували сигнатурний білок запалення каспази-1 p20 (фрагмент активованої каспази-1). як з’ясування ключових молекул, які можуть викликати запалення.Результати показали, що альфа-2 і альфа-7.3 гіардини можуть індукувати експресію p20 каспази-1, подібну до GEV.Не було виявлено жодного впливу на активацію каспази-1 у необробленому негативному контролі (тільки PBS) і контрольній плазміді pcDNA3.1(+) (рис. 1).
Вимірювання активації p20 каспази-1 за допомогою pcDNA3.1(+)-alpha-2 і alpha-7.3 giardins.Рекомбінантні еукаріотичні експресійні плазміди pcDNA3.1(+)-alpha-2 і alpha-7.3 giardine (над кожною доріжкою) трансфікували в первинні перитонеальні макрофаги миші, а супернатанти культури збирали через 24 години.Вестерн-блоттинг використовувався для вимірювання рівнів експресії характерного протеїну запалення каспази-1 p20.Групу лікування лише PBS (смуга C) і групу монотерапії pcDNA3.1(+) (смуга pcDNA3.1) використовували як негативний контроль, а групу лікування GEV використовували як позитивний контроль.Експресію рекомбінантного білка було підтверджено шляхом виявлення гістидинової мітки в кожному білку, і очікувані білкові смуги були альфа-2 гіардином (38,2 кДа) і альфа-7,3 гіардином (37,2 кДа).GEV, позаклітинні везикули Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-лінеаризований вектор, SUP, супернатант
Щоб визначити, чи індукують альфа-2 гіардін і альфа-7.3 гіардін експресію p20 каспази-1 і відіграють роль в активації запальної відповіді NLRP3 господаря, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine і pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin трансфікували в первинні перитонеальні макрофаги миші рекомбінантною плазмідною ДНК і визначали рівні експресії, локалізації та олігомеризації ключових запальних білків NLRP3.У цьому експерименті GEV використовувався як група позитивного контролю, а група без лікування (тільки PBS) або група лікування трансфекцією pcDNA3.1(+) була негативною групою.Результати показали, що, як і в групі GEV, рекомбінантна плазмідна ДНК giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 і giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 призвела до активації NLRP3, pro-IL-1β і активація прокаспази-1 та каспази-1 (рис. 2а).Крім того, обидва гіардини індукували значну секрецію IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; альфа-2 гіардін: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;альфа-7,3 гіардін: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Малюнок 2b).Більшість білків ASC були мономерними в групі без лікування або в групі лікування, трансфікованих плазмідою pcDNA3.1(+), на відміну від pcDNA3.1(+)-alpha-2 або pcDNA3.1(+)-alpha- 7,3 гіардін.Олігомеризація ASC відбулася в рекомбінантній плазмідній ДНК групи або групи позитивного контролю GEV, демонструючи олігомерну форму (рис. 2c).Ці попередні дані свідчать про те, що альфа-2 гіардін і альфа-7,3 гіардін можуть індукувати активацію запалення NLRP3.Подальші імунофлуоресцентні дослідження локалізації ASC і NLRP3 показали, що в групі негативного контролю білок ASC був розсіяний по всій цитоплазмі та з’являвся у вигляді точкового сигналу при стимуляції pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.Група 1(+)-альфа-7,3 гіардину або позитивна контрольна група GEV (рис. 2d).У негативному контролі та групах pcDNA 3.1, оброблених плазмідами, сигнал білка NLRP3 не було виявлено, тоді як флуоресцентний сигнал точковий у відповідь на pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 було виявлено..giardine виявляються в цитоплазмі або при стимуляції HEV (рис. 2e).Ці дані додатково демонструють, що G. duodenalis giardin alpha-2 і giardin alpha-7.3 активують інфламмасому NLRP3 у первинних перитонеальних макрофагах миші.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin і pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin активують NLRP3 inflammasome в перитонеальних макрофагах миші.Трансфікуйте рекомбінантні еукаріотичні експресійні плазміди pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin та pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin у первинні мишачі перитонеальні макрофаги та клітини або збирайте супернатант протягом 24 годин для аналізу експресії, олігомеризації , секреція.і локалізація ключових запальних білків.Групу, яка отримувала лише PBS (C), і групу одноразового лікування pcDNA3.1(+) використовували як негативний контроль, а групу лікування GEV використовували як позитивну групу.Ключові запальні білки NLRP3, включаючи NLRP3, про-IL-1β, про-каспазу-1 і р20-каспазу-1, були виявлені за допомогою вестерн-блоттингу.b Рівні секреції IL-1β у супернатантах визначали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA).Відмінності між контрольною та експериментальною групами аналізували методом одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з використанням програмного забезпечення SPSS версії 22.0.Зірочки вказують на значні відмінності між групами **P<0,01 і ***P<0,001.c Рівні олігомеризації ASC у гранулах визначали за допомогою DSS-аналізу зшивання, тоді як рівні ASC у клітинних лізатах використовували як контроль завантаження.d Візуалізація локалізації ІСК за допомогою імунофлюоресценції.e Імунофлуоресценцію використовували для візуалізації локалізації NLRP3.ASC, апоптотичний плямистий білок;IL, інтерлейкін;NLRP3, нуклеотид-зв'язуючий олігомеризаційний рецептор 3;ns, незначно (P > 0,05)
І G. duodenalis, і GEV, які він секретує, активують інфламмасому NLRP3 і регулюють запальні реакції організму in vitro.Таким чином, роль інфламмасоми NLRP3 у патогенності G. duodenalis залишається неясною.Щоб дослідити цю проблему, ми розробили експеримент між мишами, інфікованими кістою G. duodenalis, і мишами, інфікованими кістою G. duodenalis + лікування інгібітором MCC950, і порівняли експресію запалення NLRP3 при інфікуванні кістою G. duodenalis.Детальну схему експерименту наведено на рис. 3а.Зміни маси тіла мишей у різних групах лікування спостерігали протягом 7 днів після зараження цистами, і результати показані на фіг. 3b.Порівняно з групою, яка отримувала чистий PBS, результати показали, що (i) маса тіла мишей, інфікованих кістою G. duodenalis, зменшилася з дня 3 до дня 7 після інфікування;(ii) лікування інгібітором MCC950 не мало значного впливу на масу тіла мишей..Порівняно з групою з одноразовою інфекцією, BW групи дуоденальної інфекції, яка отримувала MCC950, зменшився різним ступенем (День 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; День 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; День 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; День 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; День 5: ANOVA, F (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; День 6: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175; День 7: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Ці дані демонструють, що інфламмасома NLRP3 захищає мишей від значної втрати ваги на ранніх стадіях (2-4 дні) дуоденальної інфекції.Потім ми мали на меті виявити трофозоїти G. duodenalis у промивній рідині дванадцятипалої кишки, і результати показані на малюнку 3c.Порівняно з групою інфікування кістою G. duodenalis, кількість трофозоїтів у дванадцятипалій кишці значно зросла після блокування інфламасоми NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Тканини дванадцятипалої кишки, пофарбовані HE, показали, порівняно з негативним контролем, обробленим лише PBS і MCC950: (i) інфекція кісти G. duodenalis призвела до пошкодження ворсинок дванадцятипалої кишки (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) та атрофія крипт (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) дванадцятипала кишка від мишей, інфікованих кістами G. duodenalis і оброблених інгібіторами MCC950.ворсинки дванадцятипалої кишки були пошкоджені та мертві (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) з атрофією та розгалуженням крипт (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (рис. 3d- е) .Ці результати свідчать про те, що інфламмасома NLRP3 відіграє певну роль у зниженні патогенності G. duodenalis.
Роль інфламмасоми NLRP3 в інфекції лямблій дванадцятипалої кишки.Мишам вводили (в/в) дуоденококові кісти, а потім лікували MCC950 або без нього (в/в).В якості контролю використовували окремі групи лікування PBS або MCC950.Дослідна група та схема лікування.b Масу тіла мишей у кожній з різних груп лікування контролювали протягом 7 днів.Різницю між групою інфікування G. duodenalis і групою лікування інфікування G. duodenalis + MCC950 аналізували за допомогою t-тесту з використанням програмного забезпечення SPSS версії 22.0.Зірочки вказують на значні відмінності при *P<0,05, **P<0,01 або ***P<0,001.c Паразитарне навантаження визначали шляхом підрахунку кількості трофозоїтів у промивній рідині дванадцятипалої кишки.Різницю між групою інфікування G. duodenalis і групою лікування інфікування G. duodenalis + MCC950 аналізували за допомогою t-тесту з використанням програмного забезпечення SPSS версії 22.0.Зірочки вказують на значні відмінності при *P <0,05.d Результати фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) при гістопатології дванадцятипалої кишки.Червоні стрілки вказують на пошкодження ворсинок, зелені - на пошкодження крипт.Масштабна шкала: 100 мкм.e, f Статистичний аналіз висоти ворсинок дванадцятипалої кишки та висоти крипт миші.Зірочки вказують на значні відмінності при *P<0,05 і **P<0,01.Результати взяті з 7 незалежних біологічних експериментів.BW, маса тіла;ig — внутрішньошлунковий шлях доставки;внутрішньочеревинний шлях пологів;ns, не достовірно (P > 0,05);PBS, фосфатно-сольовий буфер;WT, дикий тип
Секреція IL-1β є ознакою активації запалення.Щоб визначити, чи активують G. duodenalis альфа-2 гіардін і альфа-7.3 гіардін інфламмасому-хазяїн NLRP3 in vivo, ми використовували необроблених мишей WT (підставна група) і мишей із заблокованою інфламасомою NLRP3 (група лікування, інгібована MCC950).Детальну схему експерименту наведено на рис. 4а.Експериментальні групи складалися з мишей, які отримували PBS, лікування кіст G. duodenalis за допомогою зонду, внутрішньом’язову ін’єкцію pcDNA3.1 та внутрішньом’язову ін’єкцію pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.На 7-й день після внутрішньом'язового введення рекомбінантної плазміди збирали сироватку та визначали рівень IL-1β у кожній групі.Як показано на малюнку 4b, у групі MOCK: (i) порівняно з групою PBS, лікування pcDNA3.1 не мало істотного впливу на секрецію IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), проте, Секреція IL-β була значно підвищена в групі кісти G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine та pcDNA3.1. Внутрішньом’язова ін’єкція альфа-7,3 гіардину значно підвищила рівень сироваткового IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine індукує високі рівні секреції IL-1β у групі внутрішньом’язової ін’єкції pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Порівняно з кожною групою в групі лікування MCC950 і групі MOCK: (i) рівні секреції IL-1β у контрольній групі PBS і контрольній групі pcDNA3.1 знизилися до певної міри після блокування інгібітора MCC950, але різниці не було значущий (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) після блокування MCC950., секреція IL-1β була значно знижена в групі інфікованих кістою G. duodenalis, групі pcDNA3.1-alpha-2 giardine та групі pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, P = 0,0164).Ці результати свідчать про те, що альфа-2 гіардін і альфа-7,3 гіардін опосередковують активацію інфламмасоми NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-гіардини активують інфламмасому хазяїна NLRP3 in vivo.Мишей імунізували (IM) рекомбінантною еукаріотичною експресійною плазмідою pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, а потім лікували MCC950 (ip; група MCC950) або ні (фіктивна група) ).Групу лікування PBS або плазмідою pcDNA3.1(+) використовували як негативний контроль, групу лікування кісти G. duodenalis використовували як позитивний контроль.Дослідна група та схема лікування.b Рівні IL-1β у сироватці крові у мишей вимірювали на 7-й день методом ELISA.Відмінності між групами в групі MOCK аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу, а відмінності між групою MOCK і групою MCC950 аналізували за допомогою t-тесту програмного забезпечення SPSS версії 22.0.Зірочки вказують на значні відмінності між групами лікування в групі MOCK, *P<0,05 і ***P<0,001;знаки долара ($) вказують на значні відмінності між кожною групою в групі MOCK і групі MCC950 при P<0,05.Результати семи незалежних біологічних експериментів.i, внутрішньом’язова ін’єкція, ns, незначно (P > 0,05)
Щоб дослідити вплив опосередкованої альфа-2 і альфа-7.3 гіардином активації інфламмасоми-господаря NLRP3 на інфекційність G. duodenalis, ми використали мишей WT C57BL/6 і ввели альфа-2 гіардін і альфа-7.3 гіардін.плазміду вводили внутрішньом'язово, через 3 дні через шлунковий зонд кісти G. duodenalis, після чого мишей спостерігали протягом 7 днів.Детальну схему експерименту наведено на рис. 5а.Щодня вимірювали масу тіла кожної миші, на 7-й день після введення через шлунковий зонд відбирали зразки свіжої тканини дванадцятипалої кишки, вимірювали кількість трофозоїтів і спостерігали гістопатологічні зміни.Як показано на малюнку 5b, із збільшенням часу годування BW мишей у кожній групі поступово збільшувався.МТ мишей починав знижуватися на 3-тю добу після внутрішньошлункового введення цист G. duodenalis, а потім поступово підвищувався.Активація інфламмасоми NLRP3, індукована внутрішньом’язовою ін’єкцією альфа-2 гіардину та альфа7.3 гіардину, значно послабила втрату ваги у мишей (День 1: pcDNA3.1-альфа-2 гіардін, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 День 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 День 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; День 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; День 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 День 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; День 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, День 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, День 5: pcDNA3.1-alpha - 2 гіардини, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 День 5: pcDNA3.1-alpha -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 День 6: pcDNA3 .1 - альфа-2 гіардін, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, День 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;День 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 День 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Паразитарне навантаження оцінювали в дванадцятипалій кишці (рис. 5в).Порівняно з необробленим позитивним контролем і групою, якій вводили порожній вектор pcDNA3.1, кількість трофозоїтів G. duodenalis була значно знижена в групах, яким вводили α-2 гіардін і α-7,3 гіардін (pcDNA3.1-alpha -2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Крім того, гіардін альфа-7,3 був більш захисним у мишей, ніж гіардін альфа-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Результати фарбування HE наведені на рис.5d–f.У мишей, яким вводили альфа-2 гіардін і альфа-7,3 гіардін, було менше уражень тканини дванадцятипалої кишки, що проявляється пошкодженням ворсинок, порівняно з мишами, яким вводили G. duodenalis, і мишами, яким вводили G. duodenalis у поєднанні з порожнім вектором pcDNA3 .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 або P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 або P = 0,0055) і знижена атрофія крипт (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 або P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 або P = 0,0191).Ці результати свідчать про те, що альфа-2 гіардін і альфа-7,3 гіардін знижують інфекційність G. duodenalis шляхом активації інфламмасоми NLRP3 in vivo.
Роль pcDNA3.1(+)-giardins в інфекції G. duodenalis.Мишей імунізували (IM) рекомбінантними еукаріотичними експресійними плазмідами pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine або pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine, а потім заражали цистами G. duodenalis (ig).Групу PBS і pcDNA3.1(+) + групу лікування кісти дванадцятипалої кишки використовували як групи негативного контролю, а групу лікування кісти дванадцятипалої кишки використовували як групу позитивного контролю.Дослідна група та схема лікування.b МТ мишей у кожній із різних груп лікування спостерігали протягом 7 днів після зараження.Зірочки вказують на значні відмінності між групами в групі G. duodenalis і групі pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0,05, **P <0,01 і ***P <0,001;знак долара ($) вказує на значну різницю між кожною групою G. duodenalis і групою pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0,01 і $$$P<0,001.c Паразитарне навантаження визначали шляхом підрахунку кількості трофозоїтів в 1 мл дуоденального лаважу з дванадцятипалої кишки (довжиною 3 см) і виражали як кількість паразитів на см дванадцятипалої кишки.Відмінності між групою інфікування G. duodenalis, групою pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine та групою pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з використанням програмного забезпечення SPSS версії 22.0.Зірочки вказують на значні відмінності при **P<0,01 і ***P<0,001.d Гістопатологічні зміни в дванадцятипалій кишці.Червоні стрілки вказують на пошкодження ворсинок, зелені - на пошкодження крипт.Масштабна шкала: 100 мкм.e, f Статистичний аналіз висоти ворсинок дванадцятипалої кишки миші (e) і висоти крипт (f).Відмінності між групами на малюнку 1d аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з використанням програмного забезпечення SPSS версії 22.0.Зірочки вказують на значні відмінності при *P<0,05 і **P<0,01.Результати семи незалежних біологічних експериментів.ns, незначно (P > 0,05)
Giardia duodenum є добре відомим кишковим паразитом людини та інших ссавців, який викликає лямбліоз.У 2004 році він був включений до Ініціативи ВООЗ із занедбаних захворювань через його високу поширеність протягом 6 років, особливо в громадах з низьким соціально-економічним статусом [32].Вроджена імунна система відіграє вирішальну роль в імунній відповіді на інфекцію G. duodenalis.Повідомлялося, що мишачі макрофаги поглинають і вбивають G. duodenalis, вивільняючи позаклітинні пастки [33].Наші попередні дослідження показали, що G. duodenalis, неінвазивний позаклітинний паразит, активує запальні сигнальні шляхи p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 і NLRP3 у макрофагах миші для регулювання запальних реакцій господаря, а вивільнений GEV може посилити цей процес.13], 24].Проте точні PAMP, залучені до запалення, регульованого NLRP3 інфламмасомою при GEV, і роль інфламмасоми NLRP3 у лямбліозі ще належить з’ясувати.Щоб пролити світло на ці два питання, ми провели це дослідження.
Інфламмасома NLRP3 розташована в цитоплазмі імунних клітин і може активуватися різними частинками, такими як кристали сечової кислоти, токсини, бактерії, віруси та паразити.У бактеріальних дослідженнях токсини були визначені як ключові PAMP, які активують запальні сенсори, що призводить до запалення та загибелі клітин [34].Деякі структурно різноманітні токсини, такі як гемолізин із Staphylococcus aureus [35] та Escherichia coli [36], гемолізин BL (HBL) з ентеротоксину (NHE) [37], індукують активацію запалення NLRP3.Дослідження вірусів показали, що білки вірулентності, такі як білок оболонки (E) SARS-COV-2 [38] і білок NS5 вірусу Зіка [39], є важливими PAMP, які розпізнаються рецептором NLRP3.У дослідженнях паразитів було виявлено, що багато паразитів пов’язані з активацією інфламасом господаря, наприклад Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] і Leishmania [42].Білки щільних гранул GRA35, GRA42 і GRA43, пов'язані з вірулентністю Toxoplasma gondii, необхідні для індукції піроптозу в макрофагах щурів Lewis [43].Крім того, деякі дослідження Leishmania були зосереджені на окремих молекулах, залучених до запалення NLRP3, таких як ліпофосфоглікан мембрани паразита [44] або металопротеаза цинку [45].Серед аннексиноподібного сімейства генів альфа-гіардіну було показано, що альфа-1 гіардін є потенційним кандидатом у вакцину, що забезпечує захист від G. duodenalis на моделі миші [18].У нашому дослідженні ми вибрали фактори вірулентності G. duodenalis альфа-2 і альфа-7,3 гіардини, які є унікальними для лямблій, але про які повідомляється відносно менше.Ці два цільові гени були клоновані у вектор еукаріотичної системи експресії pcDNA3.1(+) для аналізу активації запалення.
У нашій моделі миші розщеплені фрагменти каспази служать маркерами запальної активації.Після стимуляції NLRP3 взаємодіє з ASC, рекрутує прокаспази та генерує активні каспази, які розщеплюють про-IL-1β та pro-IL-18 до зрілих IL-1β та IL-18 відповідно.Запальні каспази (капази-1, -4, -5 і -11) є консервативним сімейством цистеїнових протеаз, які є критичними для вродженого захисту та беруть участь у запаленні та запрограмованій смерті клітин [46].Каспаза-1 активується канонічними інфламмасомами [47], тоді як каспази-4, -5 і -11 розщеплюються під час утворення атипових інфламмасом [48].У цьому дослідженні ми використовували мишачі перитонеальні макрофаги як модель і досліджували розщеплену каспазою-1 p20 каспазу-1 як маркер активації запалення NLRP3 господаря в дослідженнях інфекції G. duodenalis.Результати показали, що багато альфа-гіардінів відповідають за типову активацію запалення, що узгоджується з відкриттям ключових вірулентних молекул, залучених до бактерій і вірусів.Однак наше дослідження є лише попереднім дослідженням, і існують інші молекули, які можуть активувати некласичні запалення, оскільки наше попереднє дослідження виявило як класичні, так і некласичні запалення при інфекції G. duodenalis [13].Для подальшого визначення того, чи пов’язана згенерована p20 каспаза-1 із запаленням NLRP3, ми трансфікували альфа-2 та альфа-7.3 гіардини в перитонеальні макрофаги миші, щоб визначити рівні експресії білка ключової молекули та рівні олігомеризації ASC, підтверджуючи, що обидва α-гіардини активуються запальний NLRP3.Наші результати дещо відрізняються від результатів Manko-Pryhoda та ін., які повідомили, що стимуляція клітин Caco-2 тільки штамами G. muris або E. coli EPEC може збільшити інтенсивність флуоресценції NLRP3, ASC і каспази-1, хоча й незначно, але як костимуляція G. muris і E. coli підвищила рівні трьох білків [49].Ця розбіжність може бути наслідком відмінностей у виборі видів лямблій, клітинних ліній і первинних клітин.Ми також провели аналізи in vivo з використанням MCC950 на 5-тижневих самках мишей WT C57BL/6, які більш чутливі до G. duodenalis.MCC950 є потужним і селективним маломолекулярним інгібітором NLRP3, який блокує канонічну та неканонічну активацію NLRP3 у наномолярних концентраціях.MCC950 пригнічує активацію NLRP3, але не впливає на активацію запальних шляхів AIM2, NLRC4 і NLRP1 або сигнальних шляхів TLR [27].MCC950 блокує активацію NLRP3, але не пригнічує ініціацію NLRP3, вихід K+, приплив Ca2+ або взаємодію між NLRP3 і ASC;замість цього він пригнічує активацію запалення NLRP3 шляхом блокування олігомеризації ASC [27].Таким чином, ми використали MCC950 у дослідженні in vivo, щоб визначити роль інфламасоми NLRP3 після ін’єкції гіардину.Активована каспаза-1 p10 розщеплює прозапальні цитокіни pro-IL-1β та pro-IL-18 на зрілі IL-1β та IL-18 [50].У цьому дослідженні рівні IL-1β у сироватці крові мишей, які отримували гіардін з MCC950 або без нього, використовували як індикатор того, чи була активована інфламмасома NLRP3.Як і очікувалося, лікування MCC950 значно знизило рівні сироваткового IL-1β.Ці дані чітко демонструють, що G. duodenalis giardin alfa-2 і giardin alfa-7.3 здатні активувати мишачу інфламмасому NLRP3.
Значні дані, накопичені за останнє десятиліття, продемонстрували, що IL-17A є головним регулятором імунітету проти G. muris, індукуючи передачу сигналів IL-17RA, продукуючи антимікробні пептиди та регулюючи активацію комплементу [51].Проте інфекція лямблій частіше зустрічається у молодих дорослих особин, і було повідомлено, що інфекція лямблій у молодих мишей не активує відповідь IL-17A, щоб проявити свій захисний ефект [52], що спонукає дослідників шукати інші імуномодулюючі лямблії.механізми зараження гельмінтами.Автори нещодавнього дослідження повідомили, що G. muris може активувати інфламмасому NLRP3 E. coli EPEC, що сприяє виробленню антимікробних пептидів і зменшує здатність до прикріплення та кількість трофозоїтів у кишковому тракті, тим самим зменшуючи тяжкість ураження товстої кишки. захворювання, викликані бацилами [49].Інфламмасома NLRP3 бере участь у розвитку різних захворювань.Дослідження показали, що Pseudomonas aeruginosa запускає аутофагію в макрофагах, щоб уникнути загибелі клітин, і цей процес залежить від активації інфламмасоми NLRP3 [53].Для N. caninum опосередкована активними формами кисню активація інфламмасоми NLRP3 обмежує її реплікацію в хазяїні, що робить її потенційною терапевтичною мішенню [9].Встановлено, що Paracoccidioides brasiliensis індукує активацію інфламмасоми NLRP3 у дендритних клітинах кісткового мозку миші, що призводить до вивільнення запального цитокіну IL-1β, який відіграє вирішальну роль у захисті організму [10].Деякі види Leishmania, включаючи L. amazonensis, L. major, L. braziliensis і L. infantum chagasi, активують NLRP3 і ASC-залежну каспазу-1 у макрофагах, а також інфекцію Leishmania.Реплікація паразитів посилюється у мишей з дефіцитом гена NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Замбоні та ін.Повідомлялося, що інфекція Leishmania індукує активацію інфламмасоми NLRP3 у макрофагах, що обмежує реплікацію внутрішньоклітинного паразита.Таким чином, Leishmania може пригнічувати активацію NLRP3 як стратегію уникнення.У дослідженнях in vivo інфламмасома NLRP3 сприяла елімінації Leishmania, але не впливала на тканини [54].Навпаки, у дослідженнях гельмінтозів активація інфламмасоми NLRP3 пригнічувала захисний імунітет господаря проти шлунково-кишкових гельмінтозів [12].Shigella є однією з основних бактерій, що викликають діарею в усьому світі.Ці бактерії можуть індукувати продукцію IL-1β через опосередкований рецептором P2X7 відтік K+, активні форми кисню, підкислення лізосом і пошкодження мітохондрій.Інфламмасома NLRP3 негативно регулює фагоцитоз і бактерицидну активність макрофагів проти Shigella [55].Дослідження Plasmodium показали, що миші з дефіцитом AIM2, NLRP3 або каспази-1, інфіковані Plasmodium, виробляють високі рівні інтерферону 1 типу та є більш стійкими до інфекції Plasmodium [56].Однак роль альфа-2 гіардину та альфа-7,3 гіардину в індукуванні патогенної активації запалення NLRP3 у мишей незрозуміла.
У цьому дослідженні інгібування інфламмасоми NLRP3 за допомогою MCC950 зменшувало BW і збільшувало кількість трофозоїтів у промивній рідині кишечника у мишей, що призводило до більш серйозних патологічних змін у тканині дванадцятипалої кишки.Альфа-2 гіардін і альфа-7.3 гіардін активують запалення NLRP3 миші-господаря, збільшують масу тіла миші, зменшують кількість трофозоїтів у кишковій промивній рідині та полегшують патологічні ураження дванадцятипалої кишки.Ці результати свідчать про те, що G. duodenalis може активувати інфламмасому господаря NLRP3 через альфа-2 гіардін і альфа-7,3 гіардін, знижуючи патогенність G. duodenalis у мишей.
У сукупності наші результати демонструють, що альфа-2 і альфа-7.3 гіардини індукують активацію інфламмасоми-господаря NLRP3 і знижують інфекційність G. duodenalis у мишей.Таким чином, ці молекули є перспективними мішенями для профілактики лямбліозу.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Лямбліоз: огляд.Нещодавно стало відомо, що у Пет Інфламма алергія на ліки.2019; 13: 134–43.
Ескобедо А.А., Цимерман С. Лямбліоз: огляд фармакотерапії.Експертний висновок провізора.2007 рік;8: 1885–902.
Тянь Хуафен, Чень Бінь, Вень Цзяньфен.Лямбліоз, стійкість до ліків і відкриття нових мішеней.Заражає мішені наркотиків Disord.2010; 10: 295-302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T тощо. Інфламмасома NLRP3 та запальні захворювання.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Роль інфламмасоми в кишковому запаленні та раку.Гастроентерологія.2011 рік;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Канонічна та атипова активація запалення NLRP3 на перехресті імунної толерантності та запалення кишечника.преімунні.2017; 8: 36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S та ін.Опосередкована ROS активація запалення NLRP3 бере участь у відповідь на інфекцію N. caninum.Переносник паразитів.2020; 13: 449.